快速實(shí)時(shí)的PCR檢測---賽多利斯實(shí)驗室

快速實(shí)時(shí)的PCR檢測---賽多利斯實(shí)驗室

支原體是世界上最小的能夠獨立繁殖的細菌之一。它們屬于柔膜細菌目（Mollicutes），具有非常緩慢的寄生生長(cháng)方式。支原體可引起動(dòng)物和植物體內的眾多感染現象。

快速實(shí)時(shí)的PCR檢測

用于支原體DNA敏感檢測的實(shí)時(shí)PCR技術(shù)

本文以使用Vivaspin® 20 超濾管進(jìn)行DNA分離，用Microsart® AMP進(jìn)行支原體檢測為例�；�于PCR的檢測試劑盒為用戶(hù)提供可靠、穩定的檢測結果，耗時(shí)只需3小時(shí)，該方法簡(jiǎn)易且經(jīng)濟、即取即用、靈敏度高。

支原體沒(méi)有細菌所具有的細胞壁，也就沒(méi)有抗體的攻擊點(diǎn)，因而非常難以控制。鑒于此，使用傳統的除菌過(guò)濾器（0.2μm孔徑）對支原體實(shí)現完全截留。不可忽視的是，支原體的細胞大小為0.5-0.8μm，同時(shí)具有極大的靈活性和變形能力，能夠通過(guò)除菌濾器。

支原體檢測

檢測支原體污染的方法有許多種。以生長(cháng)法舉例，在特定液體或固體的營(yíng)養培養基中進(jìn)行培養，或通過(guò)熒光顯微鏡的方式進(jìn)行檢測等都是非常普遍的方法。在目前的“金標準”里，生長(cháng)檢測需要至少有28天的培養時(shí)間，然后使用這些可用排除法確定并且緩慢生長(cháng)的細菌進(jìn)行污染。在此階段中，樣品必須要在白天可肉眼檢測，而這也需要大量的時(shí)間。

即使采用熒光顯微鏡進(jìn)行輔助檢測，依然需要至少8天的時(shí)間來(lái)排除鑒定支原體的感染。另外，操作者需要經(jīng)過(guò)專(zhuān)門(mén)培訓，擁有豐富的經(jīng)驗，并知道特殊知識，才可有能力排除對結果的干擾。

“3-小時(shí)”替代法

基于PCR的檢測試劑盒（如賽多利斯公司的Microsart®  AMP支原體試劑盒）可為用戶(hù)提供靈敏、穩定的檢測結果，耗時(shí)只需3小時(shí)。該方法簡(jiǎn)易且經(jīng)濟、試劑盒即取即用。試劑盒上僅需要一個(gè)能夠檢測熒光染料FAM和ROX的實(shí)時(shí)PCR儀即可。該PCR試劑盒適用于各種各樣的初始樣品。配合使用Vivaspin® 20或Vivaspin® 6超濾管，則可處理高達18ml的樣品體積，從而確保高的靈敏度。
實(shí)驗部分

下面所述的是一個(gè)使用Vivaspin® 20超濾管進(jìn)行DNA分離并用Microsart® AMP進(jìn)行支原體檢測的案例。

將Mycoplasma fermentans于37℃在Hayflick培養基中進(jìn)行培養，直至酚紅指示劑顏色發(fā)生輕微的改變，然后將其用1xPBS（磷酸鹽緩沖液）以1:1000的比例進(jìn)行稀釋。用移液器將18ml的稀釋樣品平均加入至每個(gè)Vivaspin® 20超濾管。為了中和非特異性化合物，在每份樣品中添加2ml的包被緩沖液。然后以3500x g的轉速離心20分鐘，直至濃縮后的剩余體積約為200μl。在200μl裂解緩沖液的協(xié)助下，將全部濃縮物轉移至一支新的1.5ml反應管中。緩沖液是用于沖洗Vivaspin® 20超濾管，以確保樣品被完全徹底地轉移。將200μl濃縮樣品和200μl裂解緩沖液組成的混合物在56℃孵育15分鐘，以促使細胞完全裂解。在該步驟之后，使用濃縮管將DNA分離。在DNA分離過(guò)程中，采用Microsart® AMP提取試劑盒，并根據試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。幾乎全部分離的DNA都要用于實(shí)時(shí)PCR（60μlDNA洗脫液中的50μl），以達到最大的敏感度。

平行測試中，在不經(jīng)過(guò)Vivaspin® 濃縮步驟的情況下，取相同初始量的DNA進(jìn)行分離，以對經(jīng)過(guò)濃縮和未經(jīng)過(guò)濃縮的樣品進(jìn)行直接對比。

根據試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，PCR反應步驟如下：

 

l 將試劑盒中反應管與凍干成分一起以最大速度離心5秒，將1275μl的緩沖液添加至引物/探針/核苷酸混合物（紅帽）中。

 

l 將300μl水（PCR質(zhì)量級別）添加至陽(yáng)性對照（綠帽）和內參對照（黃帽）中。

 

l 在室溫下孵育5分鐘，直至完全混合。

 

l 將溶液和Vortex混合物簡(jiǎn)單混合，并快速離心。

 

l 主混合物（Master Mix）的組成：每次均將49μl的引物/探針/核苷酸混合物（紅帽）和1μl的內參對照（黃帽）進(jìn)行反應，移液并混合至一支1.5ml的反應離心管中。

 

將50μl主混合物和50μl樣品或陽(yáng)性對照或陰性對照液（比如：洗脫緩沖液，PCR水，或者10mM Tris緩沖液）移液至200μl的PCR管中，并插入至經(jīng)過(guò)預設程序的實(shí)施熱循環(huán)儀中。

將濃縮樣品的Ct值（循環(huán)閾值）與未濃縮樣品持續進(jìn)行比較。Ct值是當熒光信號達到某個(gè)設定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的擴增循環(huán)數。表1列出了每一個(gè)Ct值。表2所示的是平均ΔCt值，即表1和使用或者未使用包被緩沖液樣品之間的Ct值之差。ΔCt值的測定為：ΔCt-Ct（未經(jīng)Vivaspin濃縮的樣品）-Ct（濃縮樣品）。

 

與包被緩沖液一起進(jìn)行共同濃縮后，Mycoplasma fermentans可達到ΔCt>7的Ct差值。當沒(méi)有使用包被緩沖液（個(gè)值未列出）時(shí)，記錄的ΔCt值為稍低一點(diǎn)的6，盡管這一結果可能是由于Vivaspin® 超濾管的離心時(shí)間更短而造成的。不過(guò)，它仍然顯示了在靈敏度上有了顯著(zhù)的提高。

 

靈敏度以及時(shí)間等參數對于支原體污染的調查而言是至關(guān)重要的。在濃縮步驟中，這些參數在PCR試劑盒中都會(huì )有詳細描述。通過(guò)使用Vivaspin® 20，Ct值可提高到ΔCt>7，相應的靈敏度可以增加大約2 log的水平。這使得Microsart® AMP檢測試劑盒和Vivaspin® 20能夠成為經(jīng)濟、有效又實(shí)用的快速支原體檢測工具

實(shí)驗結果與討論

使用TaqMan® 探針進(jìn)行實(shí)時(shí) qPCR 能夠檢測支原體的DNA，起始體積 200 μl -18 ml。通過(guò)qPCR 循環(huán)對樣本DNA進(jìn)行擴增，通過(guò)軟件系統得到試驗結果。