支原體檢測之DNA熒光染色法

　　原理：
　　利用熒光染劑（bisbenzimide， Hoechst 33258）偵測支原體污染。此染劑會(huì )結合到DNA之Adenosine-Thymidine （A-T） rich區域，因為支原體之DNA中A-T含量占多數（55～80%），所以可將其染色而偵測。被支原體污染之細胞經(jīng)染色后，在細胞核外與細胞周?chē)�可看到許多大小均一之熒光小點(diǎn)，即為支原體之DNA，證明有支原體之污染。 
　　測試步驟用間接步驟，將待測細胞懸浮液或細胞培養液接種于指示細胞培養液中（indicator cell，例如Vero cell or 3T6 cell），然后培養指示細胞再作熒光染色。正負反應對照組亦可以接種于indicator cell內作為對照。 
　　待測細胞亦可作直接測試，但需為吸附型細胞，培養后直接作熒光染色。有些細胞易有熒光背景，而干擾結果判讀，則建議使用接種于指示細胞之步驟。 

　　特點(diǎn)：
　　簡(jiǎn)單、經(jīng)濟與靈敏，廣泛使用，可作為例行之偵測步驟�？梢詡蓽y不易培養之支原體，例如M. hyorhinis，較直接培養法快，約一星期即可知道結果。 
　　缺點(diǎn)：有時(shí)仍會(huì )有熒光背景，影響判讀。 

　　材料：
　　Hanks’ balanced salt solution without NaHCO3 or phenol red（HBSS，GibcoBRL 21250-014﹚、bisbenzimide （Hoechst No.33258，Sigma B-2883）、thimerosol（Sigma T-5125）、0.1M citric acid、02M disodium phosphate、glycerol、glacial acetic acid、methanol、strerile H2O、chamber slide （Nunc 177380）或chamber slide替代物：35 or 60mm sterile plate內放置無(wú)菌22x22mm蓋玻片﹙浸于酒精內，使用前過(guò)火滅菌﹚，一般吸附型細胞均能吸附在蓋玻片上。染色后取出蓋玻片，細胞面朝下放在玻片上觀(guān)察。 
　　Indicator cells：Vero（African green monkey kidney，ATCC CCL-81 or CCRC 60013）or 3T6（mouse fibroblast，ATCC CCL-96 or CCRC 60070），細胞須先測試無(wú)污染。αMEM with 10%FBS（medium for Vero cell） 

　　配制試劑：
　　無(wú)菌HBSS：配制Hanks’ balanced salt solution，以0.22mm無(wú)菌過(guò)濾膜過(guò)濾滅菌。勿用高壓蒸汽滅菌。 
　　Hoechst 33258 stock solution（100X）︰稱(chēng)取5.0 mg bisbenzimide和10.0 mg thimersol溶于100ml無(wú)菌HBSS，置于棕色瓶中，室溫下以電磁攪拌器攪拌30分鐘至完全溶解后，以1ml分裝至1.5ml小離心管中，貯存于-20℃。 
　　Hoechst 33258 working reagent︰取1ml Hoechst 33258 stock solution，加入sterile 100 ml HBSS中，室溫下攪拌45分鐘，置于棕色瓶中并以鋁箔紙包覆，避免光照，貯存于4℃。 
　　mounting solution：22.2 ml 0.1M citric acid和27.8ml 0.2 M Na2HPO4加入于50ml glycerol中混合，以1N NaOH調整pH至5.5（pH很重要），貯存于4℃。 
　　固定溶液（fixative）：冰醋酸與甲醇以1︰3之體積比例混合，使用前才配制。 

　　步驟： 
　　培養Vero細胞：Vero細胞可作長(cháng)期培養或制作多個(gè)冷凍保存管，測試前解凍培養。測試前一周培養Vero細胞。 
　　在接種測試樣品前一日，以trypsin-EDTA溶液處理Vero細胞，制成細胞懸浮液，以1~2x10^4 cells／ml培養于chamber slide中，每個(gè)well加入1ml細胞懸浮液，于37℃，5％CO2培養。隔日確定生長(cháng)良好后，即可接種測試樣品。 
　　接種測試樣品：樣品種類(lèi)：1ml待測之培養基，1ml待測細胞培養液（可將細胞稍微刮下﹚，0.05~0.1ml冷凍管之細胞懸浮液。 
　　將測試樣品加入chamber slide內，培養5天后，進(jìn)行Hoechst 33258的熒光染色觀(guān)察。 
　　以Acholeplasma laidlawii ATCC 23206感染Vero細胞作為正反應對照組﹙或是已感染支原體之細胞培養液或冷凍細胞液﹚，負反應對照組為Vero cell之新鮮培養基（αMEM +10%FBS）。 

　　DNA熒光染色檢測：
　　取出培養5日之Vero細胞，吸除培養液。于每個(gè)well中加入2ml 1：3混合的冰醋酸/甲醇固定液，靜置10 min后，吸除固定液。重復上述之步驟，風(fēng)干10分鐘。于每個(gè)well中，加入1ml Hoechst 33258 working solution，室溫下靜置30min。 
　　吸掉Hoechst 33258染液后，以無(wú)菌水洗滌3次，風(fēng)干后加入1滴的mounting solution，并以蓋玻片覆蓋之。 
　　以100x-400x熒光顯微鏡觀(guān)察。打開(kāi)水銀光源10 min后，以UV激發(fā)光束（330～380 nm）之濾光鏡，觀(guān)察細胞核外是否有藍色熒光小點(diǎn)或是絲狀點(diǎn)之熒光物產(chǎn)生。 

　　結果判讀：
　　若有支原體污染，在Vero細胞核外與細胞表面會(huì )出現藍色熒光小點(diǎn)或是絲狀點(diǎn)。其形狀一致，與細胞殘片染成之不規則點(diǎn)狀物不同。其熒光可維持數星期。
　　熒光顯微鏡下，只觀(guān)察到Vero細胞的細胞核，測試樣品沒(méi)有支原體的污染。（為positive result：在Vero細胞核外與細胞表面會(huì )出現藍色熒光小點(diǎn)和絲狀點(diǎn)，表示測試樣品有支原體的污染。