水平式瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA

　　實(shí)驗原理：閉合環(huán)狀質(zhì)粒、線(xiàn)性質(zhì)粒和開(kāi)環(huán)質(zhì)粒DNA由于構形不同，在加溴化乙錠的瓊脂糖凝膠電泳上呈現不同的遷移率，因而在紫外燈下觀(guān)察，能區別閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA（cccDNA）、線(xiàn)性質(zhì)粒DNA（L-DNA）和開(kāi)環(huán)質(zhì)粒DNA（ocDNA）。

　　實(shí)驗步驟：
　　1.選擇合適的水平式電泳槽，調節電泳槽平面至水平。檢查穩壓電源與正負極的線(xiàn)路。
　　2.選擇孔徑大小合適的點(diǎn)樣梳子，垂直架在電泳膠模的一端，使點(diǎn)樣梳子底部離電泳膠模底部的距離為1.0 mm。
　　3.制備0.7%瓊脂糖凝膠，100℃水浴加熱至瓊脂糖融化均勻。
　　4.用吸管取少量瓊脂糖凝膠溶液將電泳膠模四周密封好，防止澆灌瓊脂糖凝膠板時(shí)發(fā)生滲透。待瓊脂糖凝膠冷卻至60℃左右時(shí)，加入一滴溴化乙錠，搖勻，輕輕倒入電泳膠模中，瓊脂糖凝膠的厚度在3~5 mm。倒膠時(shí)要避免產(chǎn)生氣泡，若有氣泡可用吸管小心吸去。
　　5.瓊脂糖凝膠凝固后，在室溫放置20分鐘，小心拔掉點(diǎn)樣梳子和電泳膠模兩端的擋板，保持點(diǎn)樣孔的完好。
　　6.將電泳膠模放入電泳槽中，加入電泳緩沖液，使電泳緩沖液面高出瓊脂糖凝膠表面1~2 mm。如點(diǎn)樣孔內有氣泡，用吸管小心吸出，以免影響加樣。
　　7.將15mlDNA樣品與1/5體積的溴酚藍指示劑點(diǎn)樣緩沖液混合。上樣緩沖液不僅可以提高樣品的密度，使樣品均勻沉到樣品孔內，還可以使樣品帶顏色，便于上樣和估計電泳時(shí)間和判斷電泳的位置。
　　8.用微量移液器將樣品小心加入加樣孔內，記錄樣品點(diǎn)樣秩序。
　　9.蓋上電泳槽，開(kāi)啟電源開(kāi)關(guān)，最高電壓不超過(guò)5 V/cm（100~150 V恒壓電泳），使DNA從負極向正極移動(dòng)。
　　10.電泳時(shí)間隨實(shí)驗的具體要求而異。電泳一般需1~3小時(shí)。電泳完畢后關(guān)閉電源，戴一次性塑料手套取出凝膠，盡可能將所有的電泳緩沖液淋干，在254 nm 波長(cháng)的透射紫外燈下觀(guān)察。

　　提示：
　　一、瓊脂糖凝膠電泳：
　　1.瓊脂糖凝膠的性質(zhì)：瓊脂糖是從海藻中提取的一種直鏈多糖，它由D-半乳糖和3,6-脫水-L-半乳糖的殘基交替排列組成的線(xiàn)型多聚糖。當瓊脂糖加熱至90～100℃左右，即可形成清亮透明的液體。澆在模板上冷卻至40～45℃時(shí)，凝固形成凝膠。瓊脂糖帶有親水性，不含有帶電荷的基團，不引起DNA變性，又不吸附被分離的物質(zhì)，因此它是一種很好的凝膠劑。瓊脂糖凝膠可區分相差100bp的DNA片段。
　　2.DNA分子的遷移率：DNA分子在電泳中的遷移率的因素是多方面的，除了決定于DNA分子大小與構型外，還有瓊脂糖凝膠的濃度、電壓大小、緩沖液pH值和電泳時(shí)的溫度等。

　　二、實(shí)驗操作中注意的問(wèn)題：
　　1.加熱溶解瓊脂糖時(shí)應不斷地搖動(dòng)容器，使附于壁上的顆粒也完全溶解。
　　2.溴化乙錠是一種強致癌劑，并有中度毒性，因此必須十分謹慎小心。操作時(shí)一定要戴手套，用過(guò)的手套要及時(shí)將手套順手翻過(guò)來(lái)，讓污染有溴化乙錠的面朝里。
　　3.用254 nm 波長(cháng)的紫外光進(jìn)行觀(guān)察的效果比366nm清晰，但產(chǎn)生的切口DNA量也較高。紫外光對眼睛有害，觀(guān)察時(shí)應戴上眼鏡或防護面罩。