常規組織培養法

　　1)初代消化培養法

　　1. 準備：取各種已消毒的培養用品置于凈化臺面，紫外線(xiàn)消毒20分鐘。開(kāi)始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。

　　2. 布局：點(diǎn)燃酒精燈，安裝吸管帽。

　　3. 處理組織：把組織塊置于燒杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污;如懷疑組織可能污染，可先置于含有青鏈霉素的混合液中30~60分鐘。

　　4. 剪切：用眼科剪把組織切成2~3毫米大小的塊，以便于消化。加入比組織塊總量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角燒瓶中，結扎瓶口或塞以膠塞。

　　5. 消化：或用恒溫水浴，或置于37℃溫箱消化均可，消化中每隔20分鐘應搖動(dòng)一次，如用電磁恒溫攪拌器消化更好。消化時(shí)間依組織塊的大小和組織的硬度而定。

　　6. 分離：在消化過(guò)程中見(jiàn)消化液發(fā)混濁時(shí)，可用吸管吸出少許消化液在鏡下觀(guān)察，如組織已分散成細胞團或單個(gè)細胞，立即終止消化，隨即通過(guò)適宜不銹鋼篩，濾掉尚未充分消化開(kāi)的組織塊。低速(500~1000轉/分)離心消化液5分鐘，吸出上清，加入適量含有血清的培養液。

　　7. 計數：用計數板計數，如細胞懸液細胞密度過(guò)大，再補加培養液調整后，分裝入培養瓶中。對大多數細胞來(lái)說(shuō)，pH要求在7.2~7.4范圍，培養液呈微紅色，如顏色偏黃，說(shuō)明液體變酸，可用NaHCO3調整。

　　8. 培養：置于36.5℃溫箱培養，如用CO2溫箱培養，瓶口需用紗布棉塞或螺旋帽堵塞，紗布塞易生霉菌，每次換液時(shí)需要換新塞。

　　2)初代組織塊培養法

　　1. 剪切：把組織小塊置于小燒杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸靜Hanks液，用眼科剪反復剪切1mm3塊為止。

　　2. 擺布：用彎頭吸管吸取若干小塊，置于培養瓶中，用吸管彎頭把組織小塊擺布在培養瓶底部，小塊相互距離以0.5cm為宜，每一25ml培養瓶底可擺布20~30塊。

　　3. 輕輕翻轉培養瓶，另瓶底向上，注意翻瓶時(shí)勿另組織小塊流動(dòng)，塞好瓶塞，置36.5℃溫箱培養2小時(shí)左右(勿超過(guò)4小時(shí))，使小塊微干涸。

　　4. 培養：從微箱中取出培養瓶，開(kāi)塞，46度斜持培養瓶，箱瓶底腳部輕輕注入培養液少許，然后緩緩再把培養瓶翻轉過(guò)來(lái)，讓培養液慢慢覆蓋附于瓶地上的組織小塊。置溫箱中靜止培養。待細胞從組織塊游出數量增多后。再補加培養液。

　　3)傳代培養法

　　1. 吸除培養瓶?jì)扰f培養液。

　　2. 向瓶?jì)燃尤胍鹊鞍酌负虴DTA混合液少許，以能覆滿(mǎn)瓶底為限。

　　3. 置溫箱中2~5分鐘，當發(fā)現細胞質(zhì)回縮，細胞間隙增大后，立即終止消化。

　　4. 吸除消化液，向瓶?jì)茸⑷際anks液數毫升，輕輕轉動(dòng)培養瓶，把殘余消化液沖掉。注意加Hanks液沖洗細胞時(shí)，動(dòng)作要輕，以免把已松動(dòng)的細胞沖掉流失，如用胰蛋白酶液?jiǎn)为毾�化，吸除胰蛋白酶液后，可不用Hanks液沖洗，直接加入培養液。

　　5. 用吸管吸取營(yíng)養液輕輕反復吹打瓶壁細胞，使之從瓶壁脫離形成細胞懸液。

　　6. 計數板計數后，把細胞懸液分成等份分裝入數個(gè)培養瓶中，置溫箱中培養。