膠回收常見(jiàn)問(wèn)題及對策

　　1. 沒(méi)有回收到DNA片段

　　如在洗脫后，發(fā)現洗脫液中沒(méi)有DNA 片段，請檢查是否按瓶身標簽，在洗滌液中加入了無(wú)水乙醇。

　　2. 提取率低

　　1) 融膠液為酸性緩沖液，如融膠后，其pH 值升高將影響提取得率。請加入0.1 倍體積的3M 乙酸鉀(pH5.0)。

　　2) 長(cháng)時(shí)間使用后沒(méi)有更換的電泳緩沖液，其pH 值較高，將影響DNA 的吸附。請更換新的電泳緩沖液后，再進(jìn)行電泳，然后切膠。

　　3) 回收片斷大小影響回收效率(見(jiàn)下圖);

　　4) 在洗脫前，將洗脫液于30～60℃溫浴，可提高提取效率適當延長(cháng)洗脫時(shí)間可增加回收效率。

　　5) 正確估計膠大小，確保加入足夠量的Binding Buffer;使膠完全融解;

　　6) 提高Binding Buffer用量可提高小片斷DNA回收效率.對于<100bp的DNA片斷,可加入6倍體積的Binding Buffer;

　　3. 吸光度測量結果問(wèn)題

　　吸光度測量的是未知樣品與調零標準之間的相對吸光度，所以請用與洗脫液體相同的液體，對測量樣品進(jìn)行稀釋和調零。

　　4.如何計算提取率

　　1) 由于回收前樣品中，往往含有非目的DNA 片段、引物、dNTP 等，所以不能用測回收前后吸光度的的方法計算回收率。

　　2) 可將回收前后DNA 片段一起電泳，使用凝膠成像系統拍照后，用配套的軟件進(jìn)行電泳條帶灰度對比。

　　3) 注意，電泳條件及拍攝條件將對灰度對比結果造成很大影響，請仔細操作，以減小誤差。