如何選擇熒光定量PCR儀

　　在基因擴增儀的幾種類(lèi)型中，熒光定量PCR 因操作方便、運行速度快、實(shí)驗結果準確，受到越來(lái)越多的分子生物學(xué)研究者青睞。

　　實(shí)驗者要購買(mǎi)一款合適的熒光定量PCR，需要考慮各方面的因素，首先要分析實(shí)驗室目前乃至將來(lái)的需求、平衡實(shí)驗室的預算，更要詳細研究各種各樣的宣傳資料。

　　面對各種不同性能的產(chǎn)品，我們該如何選擇呢?

　　首先建議大家走出認識熒光定量PCR的兩個(gè)誤區：

　　誤區一：熒光定量PCR儀無(wú)需梯度功能

　　對于使用染料法的定量PCR反應，雖然有各種各樣的PCR引物設計軟件或者經(jīng)驗公式計算熔解溫度(Tm值)，但運用的公式不同、引物序列不同，Tm值的差異會(huì )很大。

　　引物的熔解溫度決定了退火溫度。而且模版中堿基的組合千變萬(wàn)化，對于特殊片斷，經(jīng)驗公式得到的數據不一定能得出準確的結果，退火溫度細微的差異對結果都可能產(chǎn)生決定性的影響，因而“摸條件”一度是讓人很頭疼的問(wèn)題。

　　梯度PCR的出現部分解決了一些問(wèn)題——在反應過(guò)程中每個(gè)孔的溫度控制條件可以在指定范圍內按照梯度變化，根據結果，一步就可以摸索出最適合的反應條件。

　　不單是退火溫度，連變性溫度和延伸溫度都可以?xún)?yōu)化——對于多種聚合酶混合酶擴增如Invitrogen、Clontech、Promega的多數高保真Taq酶來(lái)說(shuō)這個(gè)非常重要，因為T(mén)aq和校正酶的最佳反應溫度可能有顯著(zhù)差異，優(yōu)化延伸溫度就顯得很重要。

　　使用有梯度功能的熒光定量PCR可以一次完成以往多次實(shí)驗才能完成的優(yōu)化過(guò)程，簡(jiǎn)化了摸索 PCR反應條件的繁瑣實(shí)驗，既節省實(shí)驗時(shí)間提高效率，又節省實(shí)驗成本。

　　誤區二：儀器通道越多越好

　　隨著(zhù)PCR技術(shù)的成熟運用，多重擴增越來(lái)越熱鬧，熒光定量PCR儀也不能幸免。

　　從最初ABI公司推出的單通道熒光定量PCR儀發(fā)展到如今各個(gè)廠(chǎng)家都推出4通道、5通道甚至6通道熒光定量PCR儀，眼花繚亂的選擇讓人無(wú)所適從，就有人一不小心走進(jìn)了“通道越多越好”的誤區。

　　在使用有些廠(chǎng)家5通道的熒光定量?jì)x時(shí)，為了確保實(shí)驗結果的精確性和準確性都要在實(shí)驗中使用ROX(一種熒光染料)或專(zhuān)用的Reference dye ，這些熒光染料都必須單獨使用一個(gè)檢測通道。

　　所以，真正能檢測多重PCR熒光信號的有效通道只有4個(gè)，而且使用校正染料可能會(huì )增加后期的使用成本。

　　有的熒光定量PCR的檢測通道是只為自已廠(chǎng)家的專(zhuān)用的熒光染料或試劑開(kāi)放的，有效檢測通道也絕非像宣傳資料中宣稱(chēng)的那么多。

　　在購買(mǎi)前確認熒光定量PCR儀器的有效檢測通道尤為重要，不能單單只聽(tīng)宣傳。

　　考慮多重熒光定量PCR的通道數的時(shí)候也應該從實(shí)驗室實(shí)際情況出發(fā)，多重PCR并非人人適用、人人可用，因為它使實(shí)驗復雜化了。

　　當我們看清誤區，在選擇一款最適合自己需求的熒光定量PCR儀時(shí)，我們又該關(guān)注些什么呢?

　　1、 運行速度

　　在熒光定量PCR儀的眾多技術(shù)參數中，升降溫速度也是廠(chǎng)家喜歡大力宣傳的指標。更快的升降溫，可以縮短反應進(jìn)行的時(shí)間，而且縮短了可能的非特異性結合、反應的時(shí)間，提高PCR的特異性。為了更好的完成實(shí)驗，各個(gè)廠(chǎng)家紛紛推出能快速運行的熒光定量PCR儀。例如ROCHE推出的Lightcycler2.0利用空氣動(dòng)力學(xué)原理，可在半小時(shí)左右完成30-40個(gè)循環(huán)。ABI的7500可以選配FAST模塊擁有5°C/秒的升降溫速度，可在40分鐘左右完成30-40個(gè)循環(huán)。最近eppendorf新推出的Mastercycler ep realplex4S 和2S的銀質(zhì)模塊熒光定量PCR儀 ，升降溫的速度可達到6℃/秒和4.5/秒，是目前同類(lèi)產(chǎn)品中升降溫速度最快的熒光定量PCR 儀。一個(gè)在其他儀器上原本需要40—60分鐘的PCR反應，eppendorf Mastercycler ep realplex4S 和2S (銀質(zhì)模塊)只需運行28分鐘——別小看這節約下來(lái)的幾十分鐘，一天下來(lái)就可以多運行好幾輪了。

　　2、 靈活性

　　大規模繁忙的實(shí)驗室設備固然讓人羨慕，但是常規實(shí)驗室同樣可以有精彩的選擇�，F在的儀器供應商擁有眾多技術(shù)專(zhuān)家，有的還能提供整個(gè)分子生物學(xué)的基礎研究平臺，不但了解、滿(mǎn)足您現在的需求，而且還考慮到了你可能變化的需求——升級和更換模塊。Bio-rad的Mycycler就可以選擇模塊升級為定量PCR儀。ABI的7900可以選擇將96孔槽變?yōu)?84孔槽。像離心式的雙通道的Rotor-gene3000A 就可以根據您研究的需要升級成四通道的熒光定量PCR儀。Eppendorf公司在這方面考慮的就更加周全，如實(shí)驗室已經(jīng)擁有Mastercycler ep可以按照您的要求升級為Mastercycler ep realplex熒光定量PCR儀，而且可升級的型號有4種：2通道銀質(zhì)、鋁制模塊和4通道銀質(zhì)、鋁制模塊。您可以根據自己的經(jīng)費和實(shí)驗需要購買(mǎi)、升級任何一款Mastercycler ep realplex熒光定量PCR儀。

　　3、 儀器的檢測通量

　　在購買(mǎi)定量PCR儀的時(shí)候要根據實(shí)驗室的需要來(lái)選擇不同通量的儀器。目前市面上的熒光定量PCR的檢測通量小到16個(gè)多到384個(gè)。

　　如果進(jìn)行一般的基因表達研究或病原體檢測，實(shí)在不必購買(mǎi)昂貴的儀器，96孔的通量足夠用;需要尋找要新藥靶點(diǎn)和疾病標記的實(shí)驗室可以考慮購買(mǎi)384孔板的儀器。假如經(jīng)費有限無(wú)法購買(mǎi)384孔板儀器的實(shí)驗室，可以考慮購買(mǎi)運行速度快(帶有FAST模塊)的96孔板熒光定量PCR儀。

　　有了高通量的儀器，你會(huì )發(fā)現樣品的制備和小體系、多樣本的PCR體系構建成為限制實(shí)驗速度和結果的頸瓶。

　　4、 硬件設計特點(diǎn)

　　熒光定量PCR儀主要有傳統的96孔板式、創(chuàng )新的離心式等，每種設計都有它的獨到之處但也都有無(wú)法避免的缺憾。

　　傳統的96孔板的熒光定量PCR可以容納的樣本量大，而且無(wú)需特殊的耗材。有些傳統的96孔板的儀器采用鹵鎢燈激發(fā)、CCD檢測，這些光學(xué)結構在96孔板的頂部，每個(gè)樣品孔距光源和檢測器的光程各不相同——邊緣效應，對結果產(chǎn)生影響。

　　為了保證精確、準確的實(shí)驗結果，這類(lèi)儀器在實(shí)驗過(guò)程中通常會(huì )使用ROX(一種熒光染料)或專(zhuān)用的Reference dye作為參照校正實(shí)驗結果。

　　鹵鎢燈的使用壽命短、更換成本較高已經(jīng)成為很多用戶(hù)頭痛的問(wèn)題。在實(shí)驗過(guò)程中鹵鎢燈作為一種熱光源，產(chǎn)生較多熱能對實(shí)驗結果有一定的影響。

　　CCD最大的優(yōu)點(diǎn)就是可以同時(shí)掃描所有樣品中的熒光信號，但是靈敏度較低，而且同時(shí)檢測樣品間的熒光信號存在干擾。像ABI、Bio-rad 公司生產(chǎn)的熒光定量PCR就屬于這一種。但Bio-rad的IQ系列熒光定量PCR帶有梯度功能。

　　創(chuàng )新的離心式的儀器通常選用LED激發(fā)、PMT檢測，離心式的設計上避免了邊緣效應。LED光源是冷光源對實(shí)驗沒(méi)有影響，因此無(wú)需采用其他熒光染料校正儀器，而且使用壽命長(cháng)無(wú)需經(jīng)常更換。PMT每次只能收集單個(gè)熒光信號，但是檢測靈敏度高。

　　但這類(lèi)儀器運行速度非�？�，但也存在樣本量小、耗材昂貴、沒(méi)有梯度功能、存在時(shí)間積分等缺點(diǎn)。Corbett 的Rotor-gene系列和Roche 的Lightcycler系列均為這一類(lèi)儀器。

　　隨著(zhù)熒光定量PCR技術(shù)的使用，聰明的儀器生產(chǎn)商紛紛在傳統的96孔板儀器上大作改進(jìn)。

　　首先是Stratagene的Mx3000p在檢測上突破了使用CCD改用PMT檢測熒光信號，大大提高了實(shí)驗的靈敏度，但激發(fā)光源仍然沿用傳統的鹵鎢燈并且沒(méi)有梯度功能。Eppendorf 公司推出的Mastercycler ep realplex是一款帶有梯度功能的熒光定量PCR儀，使用了96個(gè)LED為激發(fā)光源，采用先進(jìn)的CPM(第二代PMT)及96合一光纖為檢測系統，不但避免了邊緣效應還保證所有樣品間的熒光信號沒(méi)有干擾。