流式細胞儀的發(fā)展歷史及其原理與應用進(jìn)展

摘　要　流式細胞分析(flow cytometry FCM) ,即流式細胞術(shù),是用流式細胞儀(flow cytome-ter FCM) 測量液相中懸浮細胞或微粒的一種現代分析技術(shù)。它是眾多不同學(xué)術(shù)背景、不同科技領(lǐng)域相結合的結晶。它是物理學(xué)、生物學(xué)、醫學(xué)等綜合運用的產(chǎn)物。本文就流式細胞術(shù)的發(fā)展歷史、流式細胞儀的原理及在各領(lǐng)域的應用進(jìn)行綜述,闡明現代流式細胞術(shù)由于結合單克隆抗體技術(shù)、定量熒光細胞化學(xué)技術(shù),使其在生物學(xué)、臨床醫學(xué)、藥物學(xué)、材料學(xué)等眾多研究領(lǐng)域中的應用有更加突飛猛進(jìn)的發(fā)展。

關(guān)鍵詞　流式細胞術(shù)(FCM) 　歷史　原理　應用

流式細胞分析(flow cytometry FCM) 即流式細胞術(shù),是用流式細胞儀(flow cytometer FCM) 測量液相中懸浮細胞或微粒的一種現代分析技術(shù)。它凝結眾多不同學(xué)術(shù)背景、不同科研領(lǐng)域科學(xué)家的心血。從流式細胞術(shù)的發(fā)明、發(fā)展直到今天在各個(gè)領(lǐng)域應用的拓展,每一步都是諸如電子技術(shù)、流體力學(xué)、計算機科學(xué)、激光技術(shù)、生物學(xué)、生物技術(shù)、高等數學(xué)、臨床醫學(xué)、分子生物學(xué)、有機化學(xué)和生物物理學(xué)等學(xué)科知識綜合運用的結晶�，F代流式細胞術(shù)更是由于它結合單克隆抗體技術(shù)、定量細胞化學(xué)技術(shù)和定量熒光細胞化學(xué),使其在生物學(xué)、臨床醫學(xué)、藥物學(xué)、材料學(xué)等眾多研究領(lǐng)域中的應用有更加突飛猛進(jìn)的發(fā)展。流式細胞術(shù)的發(fā)展史也就是各個(gè)相關(guān)學(xué)科的發(fā)展史的縮影。

1 　流式細胞術(shù)的發(fā)展歷史

1930 年,Casperrsson 和Thorell 開(kāi)始致力于細胞的計數;1934 年,Moldaven 是世界上最早設想使細胞檢測自動(dòng)化的人,他試圖用光電儀記錄流過(guò)1 根毛細管的細胞數量;1936 年,Caspersson 等引入顯微光度術(shù);1940 年,Coons 提出用結合熒光素的抗體去標記細胞內的特定蛋白;1947 年,Guclcer 運用層流和湍流原理研制煙霧微粒計數器;1949 年,Coulter 提出在懸液中計數粒子的方法并獲得專(zhuān)利;1950 年,Caspersson 用顯微分光光度計在紫外(UV) 和可見(jiàn)光光譜區檢測細胞;1953 年,Croslannd2Taylor 應用分層鞘流原理,成功地設計紅細胞光學(xué)自動(dòng)計數器;1953年,Parker 和Hutcheon 描述一種全血細胞計數器裝置,成為流式細胞儀的雛形; 1954 年, Beirne 和Hutchcon 發(fā)明光電粒子計數器;1959 年,B 型Coulter計數器問(wèn)世; 1965 年, Kamemtsky 等提出兩個(gè)設想:(1) 用分光光度計定量細胞成分; (2) 結合測量值對細胞進(jìn)行分類(lèi); 1967 年, Kamemtsky 和Melamed 在.Moldaven 的方法基礎上提出細胞分選的方法;1969年,Van Dilla Fulwyler 及其同事們在LosALmos ,NM(即現在的National Flow Cytometry Resource Labs) 發(fā)明第一臺熒光檢測細胞計;1972 年,Herzenberg 研制出一個(gè)細胞分選器的改進(jìn)型,能夠檢測出經(jīng)熒光標記抗體染色的細胞的較弱的熒光信號; 1975 年,Kochler 和Milstein 提出單克隆抗體技術(shù),為細胞研究中大量的特異性免疫試劑的應用奠定基礎�，F今隨著(zhù)光電技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展,流式細胞儀已開(kāi)始向模塊化發(fā)展,即它的光學(xué)系統、檢測器單元和電子系統都可以按照實(shí)驗要求隨意更換。進(jìn)入21 世紀,流式細胞術(shù)已經(jīng)日臻完善,成為分析細胞學(xué)領(lǐng)域中無(wú)可替代的重要工具。

2 　流式細胞儀的工作原理

流式細胞儀主要由4 部分組成:液流系統、光學(xué)系統、電子系統、分析系統。它只能檢測懸浮的單細胞或微粒的信號。一般是將待測細胞或微粒進(jìn)行熒光染色后制成懸液標本,在一定氣體壓力下將待測樣品壓入流動(dòng)室,用不含細胞或微粒的緩沖液(又稱(chēng)鞘液) 在高壓下從鞘液管?chē)姵?鞘液管入口方向與待測細胞或微粒流成一定角度,使鞘液包繞著(zhù)細胞或微粒高速流動(dòng),形成一個(gè)圓形的流束(即鞘流) ,待測細胞在鞘液的包裹下單行排列,依次通過(guò)流式細胞儀的檢測區域,經(jīng)激發(fā)光激發(fā)后產(chǎn)生熒光信號。流式細胞儀通常以激光作為激發(fā)光源,經(jīng)過(guò)聚焦整形后的光束垂直照射在樣品流上,被熒光染色的細胞在激光束的照射下產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光。這兩種信號同時(shí)被前向光電二極管和90°方向的光電倍增管( PMT) 接收。光散射信號在前向小角度進(jìn)行檢測,稱(chēng)為前向散射(forward～atter ,FSC) ,這種信號基本上反映細胞體積的大小;90°散射光又稱(chēng)側向散射(side scatter ,SSC) ,是指與激光束2液流平面垂直的散射光,其信號強度可反映細胞部分結構的信息。熒光信號的接收方向與激光束垂直,經(jīng)過(guò)一系列雙色性反射鏡和帶通濾光片的分離,形成多個(gè)不同波長(cháng)的熒光信號。這些熒光信號的強度代表所測細胞膜表面抗原的強度或其細胞內、核內物質(zhì)的濃度,經(jīng)光電倍增管接收后可轉換為電信號,再通過(guò)模/ 數轉換器,將連續的電信號轉換為可被計算機識別的數字信號。計算機采集所測量到的各種信號進(jìn)行計算處理,將分析結果顯示在計算機屏幕上,也可以打印出來(lái),還可以數據文件的形式存儲在硬盤(pán)上,以備日后的查詢(xún)或進(jìn)一步分析。檢測數據的顯示視測量參數的不同而有多種形式可供選擇。單參數數據以直方圖的形式表達,其x 軸為測量的散射光或熒光的強度(可以是線(xiàn)性軸,也可以選擇對數軸) ,縱軸為相對細胞數。一般來(lái)說(shuō),流式細胞儀坐標軸的分辨率有256 或1024 通道數,這視其模/ 數轉換器的分辨率而定。對于雙參數或多參數數據,既可以單獨顯示每個(gè)參數的直方圖,也可以選擇二維的散點(diǎn)圖、等高線(xiàn)圖或三維的立體視圖等。

流式細胞儀還可以對分析中的目的細胞進(jìn)行分選提取,它通過(guò)分離含有單細胞的液滴而實(shí)現的。在流動(dòng)室的噴嘴上安裝有超高頻的壓電晶體,可以產(chǎn)生高頻振蕩,使液流斷裂為均勻的液滴,待測細胞就包含在液滴之中。將這些液滴充上正或負電荷,當帶電液滴通過(guò)電場(chǎng),在電場(chǎng)的作用下發(fā)生偏轉,然后落入相應的收集器之中,從而實(shí)現細胞分選。流式細胞儀的分選速度從以往的5000 個(gè)/ s 提高到現在的25000 個(gè)/ s。

流式細胞術(shù)發(fā)展趨勢可歸納為: ①流式細胞儀從單純大型儀器發(fā)展為適應各種實(shí)際應用的便攜式、臺式、高分辨率、高質(zhì)量分選的研究型流式細胞儀; ②對流式細胞術(shù)檢測熒光參數,從采用熒光單色、雙色分析發(fā)展為多色分析,目前最多可同時(shí)檢測15 種熒光信號; ③從檢測參數的相對定量發(fā)展為絕對定量; ④從檢測參數的手動(dòng)人工分析發(fā)展為利用計算機軟件的自動(dòng)分析; ⑤所采用的熒光試劑,從非配套試劑發(fā)展為配套的試劑盒試劑。而這一切,就要求流式細胞儀使用者和科研人員,一定要不斷地有意識地學(xué)習上述各門(mén)學(xué)科知識,只有這樣才能更好地將流式細胞術(shù)應用到生物醫學(xué)的臨床實(shí)踐和基礎科學(xué)研究工作中去。