如何在現代分子生物學(xué)實(shí)驗室中應用超微量分光度計

如何在現代分子生物學(xué)實(shí)驗室中應用超微量分光光度計

核酸的定量是超微量分光光度計最常用的功能。寡脫氧核苷酸、單鏈DNA、雙鏈DNA和RNA可溶于緩沖液中，

可定量溶解.核酸最高吸收峰的吸收波長(cháng)為260nm。各核酸的分子組成不同，其轉化率也不同。為了量化不同類(lèi)型的核酸，

應事先選擇相應的系數。例如，1OD的吸光度值分別與單鏈DNA、40μg/ml的50μg/ml、37μg/ml和30μg/ml的50μg/ml的吸光度值相當。

測試后，用上述系數換算吸光度值，得到相應的樣品濃度。在試驗前，選擇正確的程序，輸入原液和稀釋劑的體積，

然后測試空白液體和樣品液體。然而，實(shí)驗并非一帆風(fēng)順。閱讀不穩定可能是實(shí)驗者最頭疼的問(wèn)題。儀器靈敏度越高，吸收值漂移越大。

事實(shí)上，超微量分光光度計的設計原理和工作原理允許吸光度值在一定范圍內變化，也就是說(shuō)，儀器具有一定的準確度和準確度。

此外，還需要考慮核酸的物理化學(xué)性質(zhì)和溶解核酸緩沖液的pH值、離子濃度等因素：在實(shí)驗中，離子濃度過(guò)高，也會(huì )導致讀數漂移。

因此，在一定的pH值和較低的離子濃度(如TE)的緩沖液中，可以很好地穩定讀數。樣品的稀釋濃度也是一個(gè)不容忽視的因素：

因為樣品中不可避免地含有一些細小的顆粒，特別是核酸樣品。這些小顆粒的存在會(huì )干擾測試效果。

為了盡量減少粒子對測試結果的影響，要求核酸的吸光度值至少為0。1A，吸光度值優(yōu)于0。1≤1.5A.在此范圍內，粒子的干擾相對較小，結果穩定。

這意味著(zhù)樣品的濃度不應太低或過(guò)高(超過(guò)光度計的測試范圍)。最后，操作因素，如充分混合，否則吸收值太低，

甚至是負值；混合物不能有氣泡，空白液體中不存在懸浮物，否則讀數漂移強烈；

必須使用相同的比色杯來(lái)測試空白液體和樣品，否則濃度差太大；轉換系數與樣品濃縮單元選擇相同；

不能使用窗口磨損的比色杯；樣品的體積必須滿(mǎn)足比色杯所要求的最小體積等。

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