新光學(xué)顯微鏡技術(shù)揭示活細胞生物過(guò)程

    來(lái)自美國霍華德休斯醫學(xué)研究所，Janelia研究園的科學(xué)家們，借助其發(fā)展的新光學(xué)超分辨率成像技術(shù)，在前所未有的高分辨率條件下研究了活體細胞 內的動(dòng)態(tài)生物過(guò)程。他們的新方法顯著(zhù)的提高了結構光照明顯微鏡(structuredilluminationmicroscopy，SIM)的分辨率， 一種最適合活體超分辨成像的技術(shù)。

　　新技術(shù)所拍攝的視頻生動(dòng)地展現了細胞內蛋白質(zhì)的運動(dòng)和相互作用。它們幫助生物學(xué)家理解細胞是怎樣改變它們之間的依存結構，以及重整細胞膜結構使得細胞 外的分子可以被吸收到細胞內。來(lái)自Janelia研究園的研究員EricBetzig博士，李棟博士后和他們的同事們基于原有的SIM顯微鏡原理新發(fā)展了兩種新的超分辨率成像技術(shù)。超分辨率光學(xué)顯微成像技術(shù)能夠跨越理論的分辨率極限，在極高的分辨率下展現細胞內的精細結構。但是，到目前為止，超分辨率顯 微鏡技術(shù)卻依然不能進(jìn)行有效的活體細胞成像。

　　“這些方法設立了超分辨率光學(xué)顯微鏡的成像速度和非侵入特性的新標準，它們使得超分辨率活體細胞成像成為現實(shí)�！盉etzig博士說(shuō)道。在傳統的 SIM顯微鏡中，物鏡下的物體被非均勻的結構光(類(lèi)似于條紋碼)所照明。在實(shí)驗中，幾束不同的結構光用來(lái)照明物體，它們和物體在不同角度混頻所產(chǎn)生的摩爾 條紋被相機依次采集。然后計算機提取摩爾條紋編碼的信息并將其解碼生成三維的高分辨率圖像。最終重建的SIM圖像具有高于傳統顯微鏡圖像2倍的空間分辨率。 リンク： www.loyuki.comサッカーユニフォーム NEW ERA ニューエラ 激安販売 ナイキ激安

　　Betzig博士和其他兩位科學(xué)家因為發(fā)展超分辨率熒光顯微鏡而被授予2014年諾貝爾化學(xué)獎。他說(shuō)道，SIM顯微鏡技術(shù)之所以沒(méi)有得到像其它方法那樣多的關(guān)注，是因為其它技術(shù)能夠提供比兩倍更高的分辨率改進(jìn)效果。但是，他強調SIM擁有兩大其它的超分辨率方法所沒(méi)有的優(yōu)勢。這些其它方法包括了兩種去 年獲得諾貝爾獎表彰的技術(shù)：他和同事HaraldHess博士于2006年開(kāi)發(fā)的光激活定位顯微鏡 (photoactivatedlocalizationmicroscopy，PALM)，和受激輻射耗盡 (stimulatedemissiondepletion，STED)顯微鏡。但是，這兩種技術(shù)都需要過(guò)多或過(guò)強的光來(lái)照明樣品，以至于熒光蛋白很快被 漂白，細胞樣品很快被損害，從而不可能長(cháng)時(shí)間進(jìn)行成像。然而，SIM在這些方面不一樣，“我愛(ài)上了SIM，因為它的速度很快，而且它所需的照明光強度遠遠 小于其它方法�！盉etzig博士說(shuō)道。

　　Betzig博士在2011年MatsGustafsson博士去世后不久開(kāi)始與SIM相關(guān)的研究。Gustafsson博士是SIM技術(shù)的先驅之一，生前也是Janelia的研究員。Betzig博士那時(shí)已經(jīng)深信SIM有潛力為解析細胞內部的工作機理提供重要的見(jiàn)解，如果SIM的空間分辨率可以被提高，它對于生物研究的可用性將被大大增強。

　　在生前，Gustafsson博士和博士生HesperRego發(fā)展了一種利用飽和耗盡(saturateddepletion)的非線(xiàn)性SIM技術(shù)，但這種技術(shù)在改進(jìn)分辨率的同時(shí)需要使用很多的光照并且散失了SIM成像速度快的優(yōu)勢。Betzig博士想到了一種可以避免這些缺陷的方法。

　　飽和耗盡非線(xiàn)性SIM利用光可反復開(kāi)關(guān)的熒光蛋白和其在開(kāi)關(guān)過(guò)程中的飽和耗盡效應來(lái)提高分辨率。它產(chǎn)生圖像的過(guò)程是，首先把所有的熒光蛋白分子激活到 可發(fā)光的狀態(tài)(亮態(tài))，然后用一束結構光把大部份的亮態(tài)分子反激活到暗態(tài)。通過(guò)結構光反激活之后，僅有少數處于結構光最弱區域的分子仍然保持在亮態(tài)。這些光調控過(guò)程提供了物體的高空間頻率信息，從而讓圖像更加清晰。這一過(guò)程需要重復25或更多次才能產(chǎn)生最終的高分辨率圖像。Betzig博士說(shuō)道，這一原理 非常類(lèi)似于STED或另一種與其相關(guān)的叫做RESOLFT的超分辨率技術(shù)的原理。

　　這一技術(shù)并不適合于活體成像，因為激活和反激活熒光蛋白需要很長(cháng)的時(shí)間。另外，反復的光照明會(huì )對細胞和熒光蛋白本身造成損傷。Betzig博士說(shuō)道，“這一技術(shù)的問(wèn)題在于你首先用光激活了所有的熒光蛋白分子，然后你馬上又用另一束光反激活了大部份分子。這些被反激活的分子對最終的圖像沒(méi)有任何貢獻，但卻被你用光“油炸”了兩次。你讓分子承受了很大“壓力”，并且花了很多你并沒(méi)有的時(shí)間，因為這段時(shí)間內細胞在運動(dòng)�！�

　　解決方法其實(shí)很簡(jiǎn)單，Betzig博士說(shuō)道：“沒(méi)有必要激活所有的分子�！痹贐etzig研究小組新發(fā)展的結構光激活非線(xiàn)性SIM的技術(shù)中，一開(kāi)始用結構光只激活樣品里的一部分熒光蛋白分子�！斑@一結構光激活過(guò)程已經(jīng)給你一些高分辨率的信息了�！盉etzig博士解釋道。另外一束結構光用于反激活分子，額外的信息可以在反激活的過(guò)程中同時(shí)被讀出。兩個(gè)結構光疊加的效應給與最終圖像62納米的分辨率，這一結果好于原始的SIM，并且把由光波長(cháng)決定的傳 統分辨率極限改進(jìn)了三倍。

　　“我們能夠做到快速地超高分辨率成像�！盉etzig博士說(shuō)道。這很重要，他補充道，因為對于動(dòng)態(tài)過(guò)程，單純提高空間分辨率而沒(méi)有相應地提高成像速度 是沒(méi)有意義的�！叭绻�細胞內部有的結構以1微米每秒的速度運動(dòng)，并且我有1微米的分辨率，那么我需要在一秒內采集圖像。但如果我有1/10微米的分辨率， 那么我就必需在1/10秒內采集圖像，不然圖像將變得模糊�！盉etzig博士解釋道。

　　結構光激活非線(xiàn)性SIM可在1/3秒內采集25幅原始圖像，并從中重建出一幅高分辨率圖像。它的圖像采集很高效，只需用較低的照明光強，并且收集每一 個(gè)亮態(tài)熒光蛋白分子所攜帶的信息。從而有效地保護了熒光分子，使得顯微鏡能夠進(jìn)行更長(cháng)時(shí)間的成像，讓科學(xué)家們可以觀(guān)測到更多的動(dòng)態(tài)活動(dòng)。

　　Betzig博士的團隊利用結構光激活非線(xiàn)性SIM獲得了在細胞運動(dòng)和改變形狀的過(guò)程中骨架蛋白的解體和自身再組裝過(guò)程，以及在細胞膜表面的叫做caveolae的微小內吞體動(dòng)態(tài)過(guò)程的影像。

　　在Science論文里，Betzig博士的團隊也利用了已經(jīng)商業(yè)化的高數值孔徑物鏡將傳統SIM的空間分辨率提高到84納米。高數值孔徑限制了被光 照明的樣品范圍，從而降低了光對細胞以及熒光蛋白分子的損傷。這一方法可以同時(shí)對多個(gè)顏色通道進(jìn)行成像，使得科學(xué)家們可以同時(shí)跟蹤幾種不同蛋白質(zhì)的活動(dòng)。

　　通過(guò)高數值孔徑的方法，Betzig博士的團隊觀(guān)測了多個(gè)骨架蛋白質(zhì)在形成粘著(zhù)斑(鏈接細胞內外的物理鏈)過(guò)程中的運動(dòng)和相互作用。他們也追蹤了clathrin修飾的內吞體的成長(cháng)和內吞過(guò)程(內吞體將細胞外的分子轉移到細胞內)。他們的定量分析回答了幾個(gè)不能被以往的成像技術(shù)所解決的問(wèn)題，例如，內吞體的分布，以及內吞體尺寸和壽命之間的關(guān)系。最后，通過(guò)結合高數值孔徑方法和結構光激活非線(xiàn)性SIM，Betzig博士和他的同事可以在超高分辨 率條件同時(shí)追蹤兩種蛋白質(zhì)的活動(dòng)。

　　Betzig博士的團隊在進(jìn)一步提高他們的SIM技術(shù)。他們也急切地盼望和生物學(xué)家一起探索潛在的應用并進(jìn)一步改進(jìn)這一技術(shù)的可用性。

　　現在，科學(xué)家們可以通過(guò)現在，科學(xué)家們可以通過(guò)JaneliaJanelia的高級成像中心利用這些新的的高級成像中心利用這些新的SIMSIM技 術(shù)，這個(gè)中心提供免費使用前沿的顯微鏡技術(shù)的機會(huì )。最后，技術(shù)，這個(gè)中心提供免費使用前沿的顯微鏡技術(shù)的機會(huì )。最后，BetzigBetzig博士說(shuō)道，使得博士說(shuō)道，使得SIMSIM成為能夠被其他實(shí)驗室獲得并能夠承擔的技術(shù)應該是比較直接的事�！按蟛糠莸摹�魔術(shù)’在于軟件而不是硬件�！背蔀槟軌虮黄渌麑�(shí)驗室獲得并能夠承擔的技術(shù)應該是比較直接的事�！按蟛糠莸摹�魔術(shù)’在于軟件而不是硬件�！�