2014最受歡迎的PCR論文

　　近日，Biotechniques網(wǎng)站介紹了2014年在該網(wǎng)站發(fā)表的5篇最有趣和最有用的PCR方法相官的論文。從這些論文我們可以發(fā)現研究人員仍在繼續改善PCR的各個(gè)方面，從基本的擴增策略到最新技術(shù)，如數字PCR。我們希望這一令人鼓舞的趨勢在來(lái)年將會(huì )繼續。

　　PCR 是現代分子生物學(xué)中的一種基本技術(shù)，所以它的任何創(chuàng )新或改進(jìn)都受到研究人員的極大歡迎。BioTechniques的編輯們一直都非常喜歡PCR方法，我們很高興看到，2014年帶來(lái)了新技術(shù)的強大選擇。在這里，我們介紹了在過(guò)去一年中發(fā)表的5篇PCR方法相關(guān)論文，范圍很廣，從基本老式PCR反應有效性和特異性的改進(jìn)，到尖端技術(shù)如數字PCR。

　　1、一種強大的耐熱DNA聚合酶鏈置換活性可顯著(zhù)改善DNA擴增結果

　　誰(shuí)不喜歡一種多功能的工具呢?當你可以用有些奇怪但很方便、孩子喜歡的叉勺時(shí)，為什么還去用勺子和叉子呢?在8月刊的 BioTechniques，Ignatov等人描述了DNA聚合酶的叉勺等價(jià)物，一種可用于常規PCR反應以及等溫擴增的DNA聚合酶。直到現在，這兩種擴增方法還需要非常不同類(lèi)型的DNA聚合酶：對于PCR來(lái)說(shuō)，一種耐熱DNA聚合酶(如Taq酶)，可以經(jīng)受住每一個(gè)PCR循環(huán)中的熱變性步驟;對于等溫擴增來(lái)說(shuō)，一種DNA聚合酶如Bst，具有很強的鏈置換活性，使DNA鏈分開(kāi)而代替熱變性。Ignatov和同事們證明，一種新型TaqDNA聚合酶突變體，具有很強的鏈置換活性，稱(chēng)為SDDNA聚合酶，不僅可用于PCR和環(huán)介導等溫擴增法(LAMP)以及最近描述的聚合酶鏈置換反應方法，而且能夠改善靈敏度和效率，即使在困難的情況下，例如長(cháng)片段PCR或GC富集模板的擴增。這種多用途的新型DNA聚合酶應該是對DNA擴增酶工具箱的一種受歡迎的補充。[文獻]

　　2、牛凝血酶可提高聚合酶鏈式反應的效率和特異性

　　當PCR不能正常工作，或產(chǎn)生非特異性擴增產(chǎn)物和引物二聚體而不是預期的擴增子時(shí)，這是非常令人沮喪的。多年來(lái)，研究人員已經(jīng)在PCR反應中添加了許多化合物，以提高DNA擴增的特異性和效率。這些添加物范圍很廣，從小的有機分子(例如甘油和甜菜堿)到非離子型洗滌劑(如TritonX-100和Tween，到蛋白質(zhì)如BSA)。不幸的是，每一種添加物只在一組特定的條件下改善PCR擴增結果。真正理想的狀態(tài)是，一種PCR增強劑在盡可能多的不同情況下都可以起作用，XinhuiLou 及其同事偶然發(fā)現了牛凝血酶(BT)。他們在12月份發(fā)表的論文中描述道，BT在低于BSA20到180倍的濃度，能改善范圍廣泛的模板DNA的PCR特異性和效率，同時(shí)還能夠緩解納米材料(如氧化石墨烯和金納米粒子)引起的抑制作用。[文獻]

　　3、在PCR之前線(xiàn)性擴增模板可改善低模板DNA的結果

　　一種重要的PCR擴增是，擴增少量的源DNA，為法醫或古DNA研究提供足夠的材料。然而，一個(gè)主要的問(wèn)題是，提供足夠多的DNA，往往必須擴大PCR循環(huán)的次數，以用于基因型分型應用，這會(huì )引起隨機抽樣效應，導致等位基因或位點(diǎn)脫離或雜合等位基因丟失，從而使基因型分型很難或者不可能。作為一種解決方案，KellyGriesdale和Angelavan Daal假設，在PCR擴增之前，與單獨PCR擴增相比，少量目標DNA的線(xiàn)性擴增用于基因型分型，將會(huì )以一種更具代表性的方式，增加模板的數量。使用這種方法，他們能夠證明，與不用pre-PCR線(xiàn)性擴增步驟的樣品相比，從越來(lái)越少的人類(lèi)基因組DNA的多重STR基因型分型重新獲得的等位基因總數顯著(zhù)提高。[文獻]

　　4、利用QIAshredder而不是限制性?xún)惹忻笧橐旱螖底諴CR準備DNA的優(yōu)點(diǎn)

　　作為PCR的最新版本，數字PCR已經(jīng)成為定量分析高準確度靶序列的一種日益流行的方法。該技術(shù)的一個(gè)重要方面在于，在PCR之前，DNA樣本在大量分區之間的平均分布，無(wú)論是在微流控well還是在微油滴。然而，當使用大量基因組DNA時(shí)，高粘度可以影響平均分區。在這些情況下，制造商通常建議在分區步驟之前限制性消化DNA樣本。然而，這樣的反應可能是費時(shí)耗力的步驟，更不用說(shuō)限制性緩沖液還會(huì )負面地影響后續的PCR。在4月份發(fā)表的一篇論文中個(gè)，Yukl等人表明，QIAshredder——含有一種生物聚合物(可降低粘度，據報道可剪切DNA)的微型離心機旋轉柱，可以代替限制性消化使用，來(lái)為液滴數字PCR(ddPCR)準備基因組DNA，從而在很寬范圍的輸入DNA數量測出更大的拷貝數。因為它節省時(shí)間和勞動(dòng)力，所以當為ddPCR準備大量基因組DNA時(shí)，QIAshredder可以被看作是限制性消化的一種不錯的替代法。[文獻]

　　5、在單一液滴數字PCR反應中同時(shí)定量可變剪接轉錄本

　　數字PCR的一個(gè)應用就是，定量來(lái)自于一個(gè)基因的可變剪接mRNA的相對數量。Yun-LingZheng及其同事們感興趣的是，檢測人端粒逆轉錄酶(hTERT)基因產(chǎn)生的20個(gè)左右的剪接變體中的4個(gè)特定剪接變體。這四個(gè)轉錄本不同之處在于，它們是否包括α外顯子和/或β外顯子，因為它們出現在許多類(lèi)型的腫瘤中，因此是潛在的癌癥生物標志物。他們擔心，以前測定這4種剪接變體(α–/β ;α /β–;α–/β–;α /β )的qPCR試驗不夠敏感，因為它們的表達水平較低，作者決定轉而使用液滴數字PCR(ddPCR)。在6月刊發(fā)表的論文中，他們設計了一種方法，在一個(gè)單一的ddPCR反應中同時(shí)測定α和β外顯子的有無(wú)，而不是用標準方法，為每個(gè)樣本設置兩次ddPCR反應，以測定每個(gè)外顯子。只使用一對PCR引物和兩種不同的雙標記熒光水解探針，Zheng的研究小組能夠在每個(gè)樣本的單次反應中比較四種剪接異構體的水平。