流式細胞儀操作規程

　　關(guān)鍵詞：流式細胞儀

　　目的：流式細胞儀開(kāi)機程序、預設獲取模式文件、設定和調整、樣品分析、關(guān)機程序

　　一.開(kāi)機程序

　　1.檢查穩壓器電源，打開(kāi)電源，穩定5分鐘。

　　2.打開(kāi)儲液箱，倒掉廢液, 并在廢液桶中加入400ml漂白水原液。打開(kāi)壓力閥，取出鞘液桶，將鞘液桶加至4/5滿(mǎn)(一般可用三蒸水，做分選必須用PBS或FACSFlow)，合上壓力閥。確實(shí)蓋緊桶蓋，檢查所有管路是否妥善安置。

　　3.將FACSCalibur開(kāi)關(guān)打開(kāi)，此時(shí)儀器功能控制鈕的顯示應是STANDBY，預熱5-10分鐘。排出過(guò)濾器內的氣泡。

　　4.如果需要打印，打開(kāi)打印機電源。

　　5.打開(kāi)電腦,等待屏幕顯示出標準的蘋(píng)果標志。

　　6.執行儀器PRIME功能一次，以排除Flow cell中的氣泡。

　　7.分析樣品時(shí)，先用FACAFlow 或PBS進(jìn)行HIGH RUN約2分鐘。

　　做過(guò)分選后，每次開(kāi)機后需沖洗管道：向分選裝置上裝上兩個(gè)50ml離心管，不接通濃縮系統，摁下右下角白色按鈕開(kāi)始沖洗。待自動(dòng)停止后接通濃縮裝置，同上法沖洗一次。

　　二.預設獲取模式文件(Acquisition Template Files)

　　1.從蘋(píng)果標志中選擇CELLQuest見(jiàn)一個(gè)新視窗，可利用此視窗編輯一個(gè)獲取模式文件。

　　2.選取屏幕左列繪圖工具中的Dot plot，繪出一個(gè)或多個(gè)Dot Plots(點(diǎn)圖)。從Dot Plot對話(huà)框中選取Acquisition作為圖形資料來(lái)源，并確定適當的x軸和y軸參數。

　　3.選取屏幕左列繪圖工具中的Histogram，同上法可繪出Histogram(直方圖)。

　　4.將此視窗命名后儲存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest Folder \EXP文件夾中，下次進(jìn)行相同實(shí)驗時(shí)可直接調用。

　　本計算機中已設定兩個(gè)模式文件：ACQ和EXP，儲存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest \EXP文件夾中，ACQ用于細胞DNA檢測，EXP用于細胞表面標志分析。

　　三.用CELLQuest進(jìn)行儀器的設定和調整

　　1.從蘋(píng)果畫(huà)面中選取CELLQuest，進(jìn)入CELLQuest后在File指令欄中打開(kāi)合適的獲取模式文件。

　　2.從屏幕上方Acquire指令欄中，選取Connect to Cytometer(快捷鍵： +B)進(jìn)行電腦和儀器的連機。將出現的Acquisiton Control對話(huà)框移至合適位置。

　　3.從Cytometer指令欄中，開(kāi)啟Detectors/Amps、Threshold、Compensation、Status等四個(gè)對話(huà)框，并將它們移至屏幕右方，以便獲取數據時(shí)隨時(shí)調整獲取條件。也可以用 +1，2，3，4獲得此四個(gè)對話(huà)框。

　　4.在Detectors/Amps對話(huà)框中，先為每個(gè)參數選擇適當的倍增模式(amplifier mode)：線(xiàn)性模式Lin或對數模式Log。一般進(jìn)行細胞表面抗原分析如分析外周血的淋巴細胞亞群時(shí)，FSC和SSC多以線(xiàn)性模式Lin測量，且DDM Param選擇FL2，而FL1, FL2與FL3則以對數模式Log測量;分析細胞DNA含量時(shí)，FSC，SSC，FL1，FL2，FL3皆以L(fǎng)in進(jìn)行測量，且DDM Param選擇FL2;分析血小板表型時(shí)，FSC，SSC，FL1，FL2，FL3等均以L(fǎng)og進(jìn)行測量。

　　5.放上待檢測的樣品，將流式細胞儀設定于RUN，流速可在HIGH 或LOW上。

　　6.在A(yíng)cquisiton Control對話(huà)框中，選取Acquire，開(kāi)始獲取細胞。在以下的儀器調整過(guò)程中隨時(shí)選取Pause，Restart以觀(guān)察調整效果。未完全調整好之前不要去掉SETUP前的“”。

　　7.在Detectors/Amps對話(huà)框中，調整FSC和SSC探測器中的信號倍增度：PMT voltages(粗調)與Amp Gains(細調)，使樣品信號出現在FSC-SSC點(diǎn)圖內,且三群細胞合理分布。

　　8.在Threshold 對話(huà)框中選擇適當的參數設定Threshold，并調整Threshold的高低，以減少噪音信號(細胞碎片)。一般做細胞表型時(shí)用FSC-H而做DNA時(shí)用FL2-H。Threshold并不影響檢測器對信號的獲取，但可改善畫(huà)面質(zhì)量。

　　9.從屏幕左列繪圖工具中選取Region(區域)，并在靶細胞周?chē)�設定區域線(xiàn)，即通常所說(shuō)的門(mén)。圈定合適的細胞群可使儀器調整更為容易。

　　10.Detectors/Amps對話(huà)框中，調整熒光檢測器(FL1, FL2, FL3, FL4等)的倍增程度。根據所用的熒光陰性對照樣品調整細胞群，使之分布在正確的區域內。

　　11.在Compensation對話(huà)框中，根據所用的調補償用標準熒光樣品調整雙色(或多色)熒光染色所需的熒光補償。比如應該為FL1+ FL2- 的細胞群卻分布在FL1+ FL2+區域內，則需調大FL2-?%FL1中的“?”，并從FL1-FL2點(diǎn)圖中觀(guān)察新的調整是否恰當

　　12.在Status對話(huà)框中可見(jiàn)：Laser Power:正常值—Run/Ready為14.7mW，Standby為5mW;Laser current:正常值為6Amps左右。

　　13.調整好的儀器設定可在Instrument Settings對話(huà)框中儲存，下次進(jìn)行相同實(shí)驗時(shí)可調出使用，屆時(shí)只需微調即可。

　　本計算機中已有三個(gè)名叫儲存于FACStation G3 \BD Applications \CELLQuest Folder \IMM-InstrSettings及FACStation G3 \BD Files \Instrument Settings Files \CalibFile和Mast-Cell-Set的參數文件，前二者可用于分析人白細胞，后者用于分析小鼠肥大細胞。

　　四.通過(guò)預設的獲取模式文件進(jìn)行樣品分析

　　1.從蘋(píng)果標志中選擇CELLQUEST，新視窗出現后從File指令欄中選擇Open，打開(kāi)預設的獲取模式文件。

　　2.從屏幕上方Acquire指令欄中，選取Connect to Cytometer進(jìn)行電腦和儀器的連機。將出現的Acquisiton Control對話(huà)框移至合適位置。

　　3.從Cytometer指令欄中選取Instrument Settings，在其對話(huà)框中選擇Open以調出以前存儲的相同實(shí)驗的儀器設定，按Set 確定。

　　4.在A(yíng)cquire指令欄中，選擇Acquisition&Storage決定儲存的細胞數，參數，信號道數。其中Resolution在做細胞表面標志時(shí)選擇256，做DNA時(shí)選擇1024。Parameter Saved…則根據不同的檢測對象選擇不同的參數。

　　5.在A(yíng)cquire指令欄中，選擇Parameter Description，以決定文件存儲位置(folder)，文件名稱(chēng)(file)，樣品代號以及各種參數的標記(panel)，即安排tube1，2，3…的檢測參數。一般本儀器獲取的數據按照檢測對象的不同分別儲存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest \IMM 和DNA 文件夾中。文件根據日期命名。

　　6.在Cytometer指令欄中，選擇Counters，將此對話(huà)框移至合適位置，以便于隨時(shí)觀(guān)察events計數。

　　7.將樣品試管放至檢測區，在A(yíng)cquire Control對話(huà)框中選取Acquire以啟動(dòng)樣品分析測定。

　　8.微調儀器設定，待細胞群分布合適后選擇Acquire Control對話(huà)框中Pause, Abort, 去除Setup前的“”，開(kāi)始正式獲取信號，存儲數據。

　　9.當一定數目的細胞被測定后，獲取會(huì )自動(dòng)停止，并會(huì )自動(dòng)存儲數據。重復步驟7，繼續分析下一個(gè)樣品，直到所有的樣品數據分析完畢。

　　當所有樣品分析分析完畢，即換上三蒸水，并將流式細胞儀置于“STANDBY”狀態(tài)，以保護激光管。

　　五.關(guān)機程序：

　　1.從File中選擇Quit, 退出軟件，選擇Don’t Save至蘋(píng)果屏幕。

　　2.用4ml 1：10稀釋的漂白水作樣品，將樣品置于旁位(vacuum is on)，以外管吸去約2ml，在將樣品架置于中位(vacuum is off)，再HIGH RUN 5分鐘(內管吸去2ml)。

　　3.改用三蒸水4ml作樣品,同上處理。

　　4.按Prime三次。

　　5.此時(shí)儀器自動(dòng)轉為STANDBY狀態(tài)，換2ml三蒸水。必須在儀器處于“STANDBY”狀態(tài) 10分鐘后再依次關(guān)掉計算機、打印機、主機、穩壓電源，以延長(cháng)激光管壽命，并確保應用軟件的正常運行。

　　6.填寫(xiě)使用登記表。