穩定高效的納升二維分離技術(shù)-在線(xiàn)雙反相色譜

　　對于微量而且復雜的樣品，如蛋白質(zhì)組學(xué)樣品、蛋白藥物中的殘留宿主細胞蛋白(HCP)等，不但需要高靈敏的納升級液相，而且需要更為充分的分離。在線(xiàn)二維納升分離技術(shù)(on-line 2D NanoLC)應運而生，并已成為微量復雜樣品液質(zhì)分析所必不可少的分離手段。

　　傳統的納升在線(xiàn)二維技術(shù)，一般采用強陽(yáng)離子交換(SCX)作為第一維，反相色譜(RP)作為第二維的分離手段。這種方法是根據樣品在鹽溶液中的離子特性與疏水性，這兩種屬性間的正交關(guān)系實(shí)現的。但是SCX-RP技術(shù)在納升級分離中卻困難重重。困難主要來(lái)自SCX分離維度。在SCX分離中需要使用濃度較高的鹽溶液作為流動(dòng)相，但含鹽流動(dòng)相易發(fā)生鹽析或導致樣品在管路內沉淀，而納升液相的管路內徑又非常小(25-100微米)。因此，在實(shí)際運用SCX-RP分離時(shí)，經(jīng)常出現管路阻塞而導致實(shí)驗失敗。

　　為此，除提供傳統的SCX-RP分離技術(shù)外，沃特世創(chuàng )造性地開(kāi)發(fā)了雙反相二維分離方法。(RP-RP)。這種RP-RP技術(shù)不必使用高濃度鹽溶液作為流動(dòng)相，避免了離子交換分離易造成的管路阻塞問(wèn)題，從而大大提高了納升二維液相的系統穩定性和實(shí)用性。更令人興奮的是，經(jīng)過(guò)哈佛醫學(xué)院的Jarrod A. Marto全面的實(shí)驗對比發(fā)現，較SCX-RP方法， 運用RP-RP分離技術(shù)得到的液質(zhì)分析結果更好RP-RP雙反相二維方法可以幫助科學(xué)家得到更多的蛋白質(zhì)分析結果.

　　這是因為：1、SCX方法使用的鹽緩沖液易產(chǎn)生離子噪音背景，從而影響質(zhì)譜數據質(zhì)量;2、SCX分離效果取決于多肽所攜帶的電荷數，而多肽攜帶電荷數量類(lèi)別有限，因此第一維SCX分離度較差，造成液質(zhì)數據信息質(zhì)量不高。

　　R P-R P雙反相分離技術(shù)在第一、第二維都使用了反相色譜，那么它是如何實(shí)現二維分離所必須的分離性質(zhì)的正交呢?原來(lái)，經(jīng)過(guò)研究發(fā)現，在不同pH值環(huán)境下，多肽的反相保留行為是不一樣的。根據這個(gè)性質(zhì)，沃特世的科學(xué)家開(kāi)發(fā)出了獨有的RP-RP納升在線(xiàn)二維系統——nanoACQUITY UPLC® System with 2D-LC。這個(gè)系統的分離柱，使用了UPLC一貫的亞二微米顆粒填料，因此具有了UPLC的超高分離度等優(yōu)點(diǎn)。此外，它還不需要分流就可以實(shí)現精準的納升流速，可為實(shí)驗室節省巨大的高純度流動(dòng)相購買(mǎi)費用及廢液處理費用，而且更加環(huán)保。nanoACQUITY UPLC System with 2D-LC雙反相二維系統優(yōu)點(diǎn)總結如下：

　　■ 較SCX-RP技術(shù)，使用RP-RP系統可得到更多的蛋白鑒定結果。

　　■ RP-RP系統較SCX-RP系統更穩定、耐用。

　　■ 與nano HPLC相比，nanoACQUITY UPLC具有UPLC超群的分離效果。

　　■ 不分流實(shí)現精準的納

　　nanoACQUITY UPLC System with 2D-LC雙反相在線(xiàn)二維系統結構及分析流程如圖3，其中包括三根色譜柱：高pH反相柱、捕獲柱、低pH反相柱。在此系統中，第一維色譜柱為高pH色譜柱。樣品進(jìn)入第一維色譜柱后，第一維梯度泵可按使用者要求，自動(dòng)地階梯式提高有機相比例，以將樣品中不同疏水性肽段分批洗脫下來(lái)。從高pH反相柱上洗脫下的多肽會(huì )被富集柱捕獲。每批次被富集的多肽，將在第二維泵的線(xiàn)性梯度模式下進(jìn)入低pH反相分析柱，在這里經(jīng)過(guò)充分分離后，樣品將到達離子源，進(jìn)入質(zhì)譜分析器。

　　其中結構示意圖。步驟①：樣品被自動(dòng)進(jìn)樣器采集后，在第一維梯度泵的推動(dòng)下進(jìn)入高pH色譜柱。步驟②：樣品在第一維泵階梯式梯度作用下，將一部分多肽沖出，后被捕獲柱富集。其中第二維梯度泵通過(guò)施加9倍于第一維泵的水相流動(dòng)相，將溶劑稀釋為適合捕獲柱富集的體系。步驟③：在六通閥切換后，第二維泵通過(guò)線(xiàn)性梯度，將多肽樣品進(jìn)行充分分離并送至質(zhì)譜分析。在執行完步驟①后，步驟②與步驟③交替進(jìn)行直到完成所需分析。雙反相在線(xiàn)二維系統nanoACQUIT Y UP LC System with2D-LC已經(jīng)在多肽的液質(zhì)分析方面被廣泛應用，幫助研究人員取得了眾多極具價(jià)值的研究成果。