教你秒懂如何使用慢病毒

病毒包裝是生物醫學(xué)研究中的一大利器。通過(guò)病毒我們可以高效地讓我們要研究的基因在目標細胞中過(guò)表達或者特異性地敲低細胞中的目標基因�？蒲兄杏玫降牟《局饕�有慢病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒。根據各種病毒不同的特性，不同的課題需要包裝不同的病毒。比如，腺相關(guān)病毒更適合進(jìn)行動(dòng)物在體研究。腺病毒具有包裝容量大、適合在體研究等有點(diǎn)。

生物醫學(xué)科研中使用得最多的是慢病毒，慢病毒具有外源基因容量大、目的基因整合穩定表達、可同時(shí)感染分裂和非分裂細胞、轉染效率高的特點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應用于基礎科研、臨床研究中。

1、預實(shí)驗的重要性

文獻報道或他人經(jīng)驗中的MOI（感染復數，毒粒與被感染細胞的數量比值），不僅取決于病毒對細胞本身的親噬性，而且受到不同來(lái)源重組病毒滴度測定誤差、使用保存過(guò)程損失、具體細胞狀態(tài)、傳代次數、細胞密度、具體實(shí)驗操作等方面的影響。完全照搬MOI可能并不能達到最佳效果。

傳代細胞系、原代細胞等材料，實(shí)際狀態(tài)在各個(gè)實(shí)驗室也會(huì )存在一定差異。預實(shí)驗的目的是找出能夠達到最高感染效率、同時(shí)細胞狀態(tài)未受到明顯影響的一個(gè)恰當病毒用量。

2、預實(shí)驗安排

設置不同MOI值的感染組�？稍O立5、10、20、50的感染復數梯度，各兩孔，一孔加入終濃度為5 ug/ml的polybrene，另一孔不加。如果只需通過(guò)熒光顯微鏡觀(guān)察，則使用96孔板即可。如需做Real-time PCR或流式檢測則至少使用24孔板。在6 h、12 h、24h左右觀(guān)察總結感染細胞狀態(tài)，在72 h左右檢測感染效率及表達水平。如為RNAi需檢測蛋白水平下調可進(jìn)一步延遲24 h。

如果有文獻報道的MOI值，可使用該值的0.5x、1x、2x、4x進(jìn)行測試。如使用較難感染的細胞進(jìn)行實(shí)驗，建議設置易感染細胞組如293、Hela、A549等作為陽(yáng)性對照。

為了便于實(shí)驗應用，且培養體系中的實(shí)際細胞數量存在計數誤差，用量預實(shí)驗的結論可總結為一定培養規模（如96孔板、6孔板）下、一定細胞密度時(shí)（如60%）、原始毒液加入體積（如5 μl）。當需要放大或縮小實(shí)驗體系時(shí)，可根據培養面積（對應細胞數）按比例換算得出病毒用量。

3、感染方法（以24孔板為例）

第一天，準備感染細胞。在24孔板中接種目的細胞約5x10⁴/孔，每孔培養基體積0.5 ml。目的細胞的狀態(tài)對于感染及表達非常重要。第二天，凍存待用的病毒于冰上融化，如需稀釋毒液可以用培養基進(jìn)行稀釋?zhuān)ɑ�礎培養基或完全培養基均可，血清、雙抗不影響病毒感染）。觀(guān)察前一天準備的細胞，狀態(tài)良好，進(jìn)行病毒感染時(shí)細胞的匯合度約為50-60%左右。

按滴度計算毒液所需的用量。如原始滴度為1x10⁸ TU /ml，每孔擬病毒用量為0.5x10⁶ TU，則需要使用原液5 ul。將所需用量的毒液加入完全培養基（500ul）、混勻，吸除孔板中原培養基，加入混合毒液的培養基。放于二氧化碳培養箱（37℃、5%CO₂）孵育培養。根據細胞狀態(tài)更換培養基，如狀態(tài)良好可在12-16h更換培養基，病毒孵育時(shí)間不短于4 h。需要使用polybrene時(shí)，在孵育培養基中先于毒液加入例如5 μg/ml終濃度的polybrene混勻。

按照正常培養基條件繼續培養48-72 h后可檢測感染效率。在倒置熒光顯微鏡觀(guān)察熒光，估計慢病毒感染目的細胞的效率。如載體未攜帶標記基因的，可以通過(guò)Real-time PCR檢測目的基因表達。慢病毒表達產(chǎn)物在72-96 h左右接近高峰，如細胞生長(cháng)代謝緩慢需適當延長(cháng)時(shí)間，生長(cháng)旺盛的細胞在48 h即可觀(guān)察基因表達。

4、實(shí)驗參考信息

（1） 常用細胞系參考MOI值

（2）常用培養器皿使用參數