原代細胞培養的幾種常見(jiàn)技術(shù)

原代細胞傳代技術(shù)

一、貼壁細胞的消化法傳代
1、吸除或倒掉瓶?jì)扰f培養液。
2、加入1ml左右消化液（胰蛋白酶或與EDTA混合液）輕輕搖動(dòng)培養瓶，使瓶底細胞都浸入溶液中。
3、消化2-5分鐘后把培養瓶放置在顯微鏡下進(jìn)行觀(guān)察，發(fā)現原貼壁的細胞逐漸趨于圓形，在還未漂起時(shí)，棄去消化液，加入培養液終止消化。
4、用吸管將貼壁的細胞吹打成懸液，分別接種到另外兩到三個(gè)培養瓶中，置37℃培養箱中繼續培養。第二天觀(guān)察貼壁生長(cháng)情況。

二、懸浮細胞的傳代
1、直接傳代 
① 讓?xiě)腋〖毎�慢慢沉淀在瓶底后，將上清吸�?/2-2/3。
② 用吸管吹打形成細胞懸液后，分別接種到另外兩到三個(gè)培養瓶中，置37℃培養箱中培養。
2、離心法傳代
 ① 將細胞連同培養液一并轉移到離心管內，離心800-1000rpm，5分鐘。
② 去除上清，加新的培養液到離心管內，用吸管吹打使之形成細胞懸液。
③ 將細胞懸液分別接種到另外兩到三個(gè)培養瓶中，置37℃培養箱中培養。

原代細胞凍存技術(shù)

1、選用生長(cháng)情況好，數量較多的原代細胞，凍存前一天換液一次。

2、貼壁細胞需用0.25％胰酶常規消化將細胞消化下來(lái)，將細胞懸液收集至離心管中。
3、1000rpm離心5分鐘，棄上清液。
4、沉淀加含DMSO的培養液，計數，調整至（1-10）×106/ml。

5、將懸液分至凍存管中，每管1ml。

6、密封凍存管，封口一定要嚴，否則復蘇時(shí)易出現爆裂。
7、用記號筆標明細胞種類(lèi)，凍存日期。

8、按下列順序降溫：室溫→4℃（20分鐘〕→冰箱冷凍室（30分鐘）→超低溫冰箱（—80℃過(guò)夜）→液氮。

原代細胞復蘇技術(shù)

1、取出細胞，迅速放入37℃溫水中快速解凍。
2、吸出細胞懸液，并加10倍以上培養液。
3、1000r/分鐘離心5分鐘，去除上清。
4、用培養液適當稀釋后接種培養瓶，放入37℃ CO2培養箱靜置培養。
鏡檢細胞貼壁能力。次日更換一次培養液，繼續培養。

原代細胞染色技術(shù)

一．臺盼藍染色
1、制備單個(gè)細胞懸液，并作適當稀釋?zhuān)?06細胞/ml)。
2、染色：取9滴細胞懸液移入小試管中，加一滴0.4%臺盼藍溶液，混勻。
3、計數：在3分鐘內，用血球計數板分別計數活細胞和死細胞。
4、鏡下觀(guān)察，死細胞被染成藍色，而活細胞拒染。
5、按公式計算細胞活力。 
 
二．伊紅Y染色
1、制備1×106-5×106細胞／ml的細胞懸液。
2、取0.1ml細胞懸液加0.1ml伊紅Y染液混合。
3、用計數板鏡下計數活、死細胞數。
4、鏡下觀(guān)察，著(zhù)紅色的為死細胞。按公式計算細胞活力。
 
三．苯胺黑染色實(shí)驗
1、制備1×106-5×106細胞／ml的細胞懸液。
2、將1份1%苯胺黑溶液與含血清生理鹽水作1：9混合稀釋?zhuān)�使其�?.1%苯胺黑染液。
3、取0.1ml細胞懸液加0.1ml苯胺黑染液混合。室溫放置10分鐘。
4、用計數板鏡下計數 ，黑色細胞為死細胞，按公式計算活細胞率。 
  
原代細胞計數技術(shù)

1、準備計數板：用酒精清潔計數板及專(zhuān)用蓋玻片，然后輕輕拭干。
2、制備細胞懸液：用消化液分散單層培養細胞或直接收集懸浮培養細胞，制成單個(gè)細胞懸液。要求細胞密度不低于104/ml，若細胞數很少，應將懸液離心（1000rpm，2分鐘），重懸浮于少量培養液中。
3、加樣：用習慣輕吹打細胞懸液，取少許細胞懸液，在計數板上蓋玻片的一側加微量細胞懸液。
4、計數：計算計數板四大格細胞總數，壓線(xiàn)細胞只計左側和上方的。然后按下式計算：細胞數/ml＝4大格細胞總數/ 4×10000。