分光光度法測定葉綠素含量

　　一、實(shí)驗目的
　　1.了解植物組織中葉綠素的分布及性質(zhì)。
　　2.掌握測定葉綠素含量的原理和方法。

　　二、實(shí)驗原理
　　葉綠素廣泛存在于果蔬等綠色植物組織中，并在植物細胞中與蛋白質(zhì)結合成葉綠體。當植物細胞死亡后，葉綠素即游離出來(lái)，游離葉綠素很不穩定，對光、熱較敏感；在酸性條件下葉綠素生成綠褐色的脫鎂葉綠素，在稀堿液中可水解成鮮綠色的葉綠酸鹽以及葉綠醇和甲醇。高等植物中葉綠素有兩種：葉綠素a 和b，兩者均易溶于乙醇、乙醚、丙酮和氯仿。

　　葉綠素的含量測定方法有多種，其中主要有：
　　1.原子吸收光譜法：通過(guò)測定鎂元素的含量，進(jìn)而間接計算葉綠素的含量。
　　2.分光光度法：利用分光光度計測定葉綠素提取液在最大吸收波長(cháng)下的吸光值，即可用朗伯—比爾定律計算出提取液中各色素的含量。
　　葉綠素a和葉綠素b在645nm和663nm處有最大吸收，且兩吸收曲線(xiàn)相交于652nm處。因此測定提取液在645nm、663nm、652nm波長(cháng)下的吸光值，并根據經(jīng)驗公式可分別計算出葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素的含量。

　　三、儀器、原料和試劑
　　儀器：分光光度計、電子頂載天平(感量0.01g)、研缽、棕色容量瓶、小漏斗、定量濾紙、吸水紙、擦境紙、滴管。
　　原料：新鮮(或烘干)的植物葉片
　　試劑：1.96％乙醇(或80％丙酮)；2. 石英砂；3. 碳酸鈣粉

　　四、操作步驟
　　取新鮮植物葉片(或其它綠色組織)或干材料，擦凈組織表面污物，去除中脈剪碎。稱(chēng)取剪碎的新鮮樣品2g，放入研缽中，加少量石英砂和碳酸鈣粉及3mL95％乙醇，研成均漿，再加乙醇10mL，繼續研磨至組織變白。靜置3～5min。
　　取濾紙1張置于漏斗中，用乙醇濕潤，沿玻棒把提取液倒入漏斗，濾液流至100mL 棕色容量瓶中；用少量乙醇沖洗研缽、研棒及殘渣數次，最后連同殘渣一起倒入漏斗中。
　　用滴管吸取乙醇，將濾紙上的葉綠體色素全部洗入容量瓶中。直至濾紙和殘渣中無(wú)綠色為止。最后用乙醇定容至100mL，搖勻。
　　取葉綠體色素提取液在波長(cháng)665nm、645nm和652nm下測定吸光度，以95％乙醇為空白對照。

　　五、計算
　　按照實(shí)驗原理中提供的經(jīng)驗公式，分別計算植物材料中葉綠素a、b和總葉綠素的含量。