酶標儀中的熒光檢測技術(shù)

1.概述：室溫下，大多數分子處于基態(tài)的最低振動(dòng)能級，處于基態(tài)的分子吸收能量（光能、化學(xué)能、電能或熱能）后躍遷至激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)不穩定，將很快衰變到基態(tài)，以光的形式放出能量，這種現象稱(chēng)為“發(fā)光現象”。分子發(fā)光包括熒光，磷光，化學(xué)發(fā)光，生物發(fā)光等。受到光照時(shí)發(fā)光，光照切斷時(shí)發(fā)光立即消失的叫熒光，光照切斷時(shí)，發(fā)光逐漸變弱以致消失的叫磷光，吸收化學(xué)反應的化學(xué)能量而發(fā)光叫化學(xué)發(fā)光，由生物能轉變?yōu)楣廨椛涞姆Q(chēng)作生物發(fā)光。
由于發(fā)光物質(zhì)不同熒光有分子熒光和原子熒光之分，分子熒光為帶光譜，原子熒光為線(xiàn)光譜，通常所說(shuō)的熒光為分子熒光。通過(guò)測定所發(fā)射熒光的特性和強度，可以對物質(zhì)進(jìn)行定性、定量分析。
2.熒光檢測技術(shù)
2.1熒光強度（FI）：熒光強度與熒光物質(zhì)的濃度成正比，這是熒光分析法是量分析的依據。在生物學(xué)上的應用非常廣泛，可以進(jìn)行生物大分子定量，酶活性分析，熒光免疫分析，細胞學(xué)分析（細胞增殖，細胞毒理，細胞吸附等）和分子間相互作用。
2.1.1細胞凋亡檢測：Caspase家族在介導細胞凋亡的過(guò)程中起著(zhù)非常重要的作用，其中Caspase-3為關(guān)鍵的執行分子，它在凋亡信號傳導的許多途徑中發(fā)揮功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個(gè)大亞基（17KD）和兩個(gè)小 亞基（12KD）組成，裂解相應的胞漿胞核底物，最終導致細胞凋亡。但在細胞凋亡的晚期和死亡細胞，caspase-3的活性明顯下降。
設計出熒光物質(zhì)偶聯(lián)的短肽Z-DEVD-AMC。在共價(jià)偶聯(lián)時(shí)，AMC不能被激發(fā)熒光，短肽被水解后釋放出AMC，自由的AMC才能被激發(fā)發(fā)射熒光。根據釋放的AMC熒光強度的大小，可以測定 caspase-3的活性，從而反映Caspase-3被活化的程度。
2.1.2細胞毒性的檢測：體外細胞毒性研究對于檢測新的生物來(lái)源或人工合成的細胞毒素以及例行的臨床相關(guān)的檢測都有著(zhù)重要的意義。細胞膜非滲透性的核染料 Propidium iodide能穿透損傷的細胞膜，熒光密度越高反映出其受損細胞越多。
2.1.3鈣流檢測：Fura-2、indo-1、Quin-2是Ca2+熒光指示劑，可以靈敏地反映細胞內鈣離子濃度的變化，當結合鈣離子時(shí)，最大激發(fā)波長(cháng)會(huì )發(fā)生改變，發(fā)射熒光的強度和結合的Ca2+濃度有著(zhù)定量的關(guān)系。
2.2熒光偏振（FP）：1926年Perrin首先描述了熒光偏振理論，溶液中的熒光分子在受到偏振光照射時(shí)，可吸收并釋放出相應的偏振熒光，如果在激發(fā)時(shí)熒光物質(zhì)處于靜止狀態(tài)，發(fā)射光將保持原有激發(fā)光的偏振性，如果其處于運動(dòng)狀態(tài)，發(fā)射光電偏振偏振平面將不同于原有激發(fā)光的偏振特性，這就是熒光偏振現象，熒光分子與其它因子的相互作用，例如相互結合或排斥；其所處環(huán)境的性質(zhì)，例如溶液的粘度、溫度等，這些因素都有可能對這個(gè)熒光因子受激發(fā)后發(fā)出的發(fā)射光的發(fā)射平面產(chǎn)生影響。因此以熒光偏振為基礎發(fā)展的技術(shù)可用來(lái)研究生命科學(xué)中分子之間的相互作用，如受體配體結合分析，DNA－蛋白質(zhì)結合分析，SNP分析，酶活性分析。
熒光偏振分析所需的樣品量少，靈敏度高，可達亞納摩爾級范圍，重復性好，操作簡(jiǎn)便，也更為安全可靠，不會(huì )在實(shí)驗過(guò)程中生成有害的放射性廢物，此外熒光偏振是真正均相的，允許實(shí)時(shí)檢測（動(dòng)力學(xué)檢測），對于濃度變化不敏感，是均相檢測形式（中間不含洗滌步驟）的最佳解決方案。
2.3時(shí)間分辨熒光（TRF）：在做熒光測定的時(shí)候，由于背景熒光信號干擾，使用傳統的發(fā)色團進(jìn)而進(jìn)行熒光檢測的靈敏度就會(huì )嚴重下降。大部分背景熒光信號是短時(shí)存在的，因此使用長(cháng)衰減壽命的標記物就可以使瞬時(shí)熒光干擾減到最小化。
時(shí)間分辨熒光是用稀土元素作為標記物，稀土三價(jià)離子的電子云的結構會(huì )一定程度上限制了電子的遷移，導致這類(lèi)元素發(fā)生的熒光的衰減周期通常是很長(cháng)的，從而消除背景熒光的干擾 大大提高檢測的靈敏度（表2）。應用稀土元素作標記物的另一個(gè)好處是激發(fā)光與發(fā)射光峰值Stoke 位移大。這就可消除激發(fā)光和散射光的干擾，同時(shí), 被激發(fā)的熒光光帶極窄, 熒光的發(fā)射峰非常尖銳, 可使儀器調整在極窄的波長(cháng)范圍內測定, 極大地降低了來(lái)自背景的各種干擾。
熒光團　　　　　　　　熒光壽命（ns）
非特異熒光背景　　　　1～10
人血清白蛋白　　　　　4.1
球蛋白　　　　　　　　3.0
細胞色素C　　　　　　3.5
異硫氰酸熒光素（FITC）4.5
丹磺酰氯　　　　　　　14
稀土螯合物　　　　　　103～106
2.4熒光共振能量傳遞（FRET）：熒光共振能量傳遞現象是Perrin在20世紀初首先發(fā)現的，1948年，Foster創(chuàng )立了理論原理，指熒光能量供體與受體間通過(guò)偶極－偶極耦合作用轉移能量的過(guò)程，這種能量的轉移是非放射性的，產(chǎn)生FRET的條件主要有三個(gè)：（1）供體與受體間足夠靠近（1～10 nm）；（2）供體的發(fā)射光譜與受體的激發(fā)光譜有一定的重疊；（3）給體與受體的偶極具一定的空間取向，這是偶極－偶極耦合作用的條件。
熒光共振能量傳遞因為要考慮到供體和受體之間的距離，所以經(jīng)常用來(lái)研究分子間的相互作用，像蛋白質(zhì)的相互作用，抗原抗體結合，受體與配體的結合，另外在膜反應、離子通道等方面的研究也有相應應用。將FRET熒光探針標記的肽鏈，加入到固體表面的雙層膜中，通過(guò)熒光漂白恢復（FRAP）成像技術(shù)檢測，為研究跨膜螺旋二聚作用提供一個(gè)新的方法。用FRET標記細胞質(zhì)，應用時(shí)間分辨技術(shù)，檢測其對P2X離子通道的門(mén)控作用。
利用Eu等長(cháng)效熒光物質(zhì)作為供體，來(lái)進(jìn)行熒光共振能量傳遞，在激發(fā)光熄滅后受體仍能較長(cháng)的能量衰減時(shí)間，能量傳遞效率更高，可檢測的相互作用距離更長(cháng)，可達到100-200nm，時(shí)間延遲檢測，降低了背景噪音，提高了靈敏度。