原代肝細胞分離方法

　　體外培養肝細胞的關(guān)鍵是如何分離得到形態(tài)完整、體外代謝活性高的肝細胞. 自1953年Anderson[2]首創(chuàng )剪切法從肝臟分離肝細胞以來(lái), 各實(shí)驗室對肝細胞的分離方法進(jìn)行了不斷改進(jìn). 在眾多方法中, 主要分為非灌流的方法和灌流的方法.

　　1.1 采用非灌流的方法

　　早期的研究一般通過(guò)非灌流這種簡(jiǎn)單的步驟分離肝細胞.

　　1.1.1 機械分離法:

　　機械分離法是利用機械剪切及強力吹打等物理手段來(lái)分離肝細胞的方法[3]. 張頂 et al[4]在分離樹(shù)鼩肝細胞的過(guò)程中, 首先將樹(shù)鼩的肝臟剪成小塊, 然后通過(guò)擠壓、剪碎和震蕩等機械手段, 使肝細胞從肝組織上脫落, 從而獲得互相分離的肝細胞.

　　1.1.2 胰酶消化法:

　　胰酶消化法是利用胰酶來(lái)破壞肝細胞之間的橋連, 使肝細胞分離的一種方法. Dulbecco et al[5]首次采用胰酶來(lái)分離猴腎細胞、大鼠肝細胞, 并運用到體外細胞的研究和培養中. 劉友平 et al[6]利用該方法分離肝細胞時(shí), 首先取出小鼠的肝組織用眼科剪剪碎至糊狀, 然后用緩沖液充分清洗并加入胰酶進(jìn)行消化. 待消化完全后用D-Hank’s液清洗, 最后加入含有血清的培養液終止胰酶的作用, 得到消化徹底的細胞懸液.

　　1.1.3 膠原酶消化法:

　　膠原酶消化法是利用膠原酶來(lái)破壞細胞間的纖維成分, 使肝細胞分離的一種方法. 王琳 et al[7]在利用該方法分離新生小鼠肝細胞時(shí), 首先將新生小鼠的肝臟剪成1 mm3組織塊, 用無(wú)鈣無(wú)鎂的D-Hank’s液反復沖洗后加入膠原酶進(jìn)行消化. 最后用DMEM液終止膠原酶的作用, 得到肝細胞懸液.

　　1.2 采用灌流的方法

　　雖然非灌流的方法以其簡(jiǎn)單易行的特點(diǎn)得到了一定的應用, 但由于存在消化不完全、分離得到的肝細胞中多細胞團塊存在的問(wèn)題, 不能滿(mǎn)足許多基礎研究或臨床應用的要求. 1969年, Berry和Friend[8]引入了肝臟灌流法, 灌流可以使消化液與肝組織更加充分地接觸, 不僅提高了分離效率, 還使分離所得肝細胞的活力和數量大大提高.

　　1.2.1 離體膠原酶灌流法:

　　離體膠原酶灌流法是將離體灌注與膠原酶消化相結合的方法. 在使用該方法分離肝細胞時(shí), 首先將動(dòng)物肝臟取出, 于門(mén)靜脈內置管或直接在獲得的肝組織塊的血管或切口內置管, 用預熱的無(wú)鈣無(wú)鎂的D-Hank’s液灌流. 然后換用膠原酶作持續灌流, 使肝細胞與間質(zhì)分離. 最后用培養液終止膠原酶的消化作用, 過(guò)濾、離心、棄上清后得到肝細胞懸液.

　　1.2.2 Seglen兩步灌流法(原位膠原酶灌注法):

　　自從引入灌流法分離肝細胞以來(lái), 許多學(xué)者根據不同的應用條件對灌流法進(jìn)行了改良. 其中Seglen[10]經(jīng)過(guò)一系列細致的研究, 創(chuàng )立了改良的Seglen兩步灌流法, 這一方法已成為應用至今的標準的原代肝細胞分離方法. 兩步灌流法主要是通過(guò)門(mén)靜脈先后用含EDTA或EGTA緩沖液和膠原酶緩沖液進(jìn)行灌注來(lái)分離肝細胞的方法. 許多學(xué)者在具體操作中, 不斷改進(jìn)兩步灌流法的灌注條件, 目的在于進(jìn)一步減少分離過(guò)程中肝細胞的損傷, 提高肝細胞的活率.

　　1.2.3 半原位膠原酶灌流法:

　　半原位膠原酶灌流法是我國學(xué)者彭齊容 et al[13]以Seglen法為基礎建立的肝細胞分離技術(shù). 俞紅 et al[14]在采用該方法分離乳豬肝細胞時(shí), 首先用無(wú)鈣無(wú)鎂的D-Hank’s液于門(mén)靜脈進(jìn)行原位灌注. 接著(zhù), 除保留門(mén)靜脈以外, 離斷肝臟血管并將肝臟移入無(wú)菌平皿中, 繼續用膠原酶進(jìn)行灌注使肝細胞與間質(zhì)細胞分離. 最后鈍性撕裂組織, 過(guò)濾洗滌后得到制備好的細胞懸液.

　　1.2.4 下腔靜脈插管的逆向膠原酶灌注法:

　　下腔靜脈插管的逆向膠原酶灌注法是在肝下腔靜脈插管, 并結合逆向膠原酶灌注來(lái)分離肝細胞的方法[9]. 在采用該方法分離肝細胞時(shí), 首先將灌注針逆向插入下腔靜脈后固定, 門(mén)靜脈開(kāi)放做流出道. 接著(zhù)用含EGTA或EDTA的灌注液進(jìn)行灌注, 一段時(shí)間后再用含有Ca2+的膠原酶進(jìn)行充分灌注. 灌流結束后, 將細胞過(guò)濾、清洗后得到制備好的肝細胞懸液.

　　1.2.5 Gerlach五步膠原酶灌流法:

　　在使用兩步灌流法分離大的肝組織塊時(shí), 仍存在消化不完全的問(wèn)題. 而Gerlach et al[15]在兩步灌流法的基礎上, 創(chuàng )立了聯(lián)合門(mén)靜脈和肝動(dòng)脈的五步膠原酶灌流技術(shù), 建立了一種高效的細胞分離方法.