動(dòng)物細胞培養

　　半連續式培養

　　1. 半連續式培養又稱(chēng)為重復分批式培養或換液培養。采用機械攪拌式生物反應器系統，懸浮培養形式。在細胞增長(cháng)和產(chǎn)物形成過(guò)程中，每間隔一段時(shí)間，從中取出部分培養物，再用新的培養液補足到原有體積，使反應器內的總體積不變。 這種類(lèi)型的操作是將細胞接種一定體積的培養基，讓其生長(cháng)至一定的密度，在細胞生長(cháng)至最大密度之前，用新鮮的培養基稀釋培養物，每次稀釋反應器培養體積的 1/2~3/4，以維持細胞的指數生長(cháng)狀態(tài)，隨著(zhù)稀釋率的增加培養體積逐步增加�；蛘咴诩毎�增長(cháng)和產(chǎn)物形成過(guò)程中，每隔一定時(shí)間，定期取出部分培養物，或是條件培養基，或是連同細胞、載體一起取出，然后補加細胞或載體，或是新鮮的培養基繼續進(jìn)行培養的一種操作模式。剩余的培養物可作為種子，繼續培養，從而可維持反復培養，而無(wú)需反應器的清洗、消毒等一系列復雜的操作。在半連續式操作中由于細胞適應了生物反應器的培養環(huán)境和相當高的接種量，經(jīng)過(guò)幾次的稀釋、換液培養過(guò)程，細胞密度常常會(huì )提高。

　　2.半連續式特點(diǎn)：

　　●培養物的體積逐步增加;

　　●可進(jìn)行多次收獲;

　　●細胞可持續指數生長(cháng)，并可保持產(chǎn)物和細胞在一較高的濃度水平，培養過(guò)程可延續到很長(cháng)時(shí)間。 該操作方式的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，生產(chǎn)效率高，可長(cháng)時(shí)期進(jìn)行生產(chǎn)，反復收獲產(chǎn)品，可使細胞密度和產(chǎn)品產(chǎn)量一直保持在較高的水平。在動(dòng)物細胞培養和藥品生產(chǎn)中被廣泛應用。

　　連續式培養

　　1. 連續式培養是一種常見(jiàn)的懸浮培養模式，采用機械攪拌式生物反應器系統。該模式是將細胞接種與一定體積的培養基后，為了防止衰退期的出現，在細胞達最大密度之前，以一定速度向生物反應器連續添加新鮮培養基;同時(shí)，含有細胞的培養物以相同的速度連續從反應器流出，以保持培養體積的恒定。理論上講，該過(guò)程可無(wú)限延續下去。

　　2.連續培養的優(yōu)點(diǎn)是反應器的培養狀態(tài)可以達到恒定，細胞在穩定狀態(tài)下生長(cháng)。穩定狀態(tài)可有效的延長(cháng)分批培養中的對數生長(cháng)期。在穩定狀態(tài)下細胞所處的環(huán)境條件如營(yíng)養物質(zhì)濃度、產(chǎn)物濃度、pH值可保持恒定，細胞濃度以及細胞比生長(cháng)速率可維持不變。細胞很少受到培養環(huán)境變化帶來(lái)的生理影響，特別是生物反應器的主要營(yíng)養物質(zhì)葡萄糖和谷氨酰胺，維持在一個(gè)較低的水平，從而使他們的利用效率提高，有害產(chǎn)物積累有所減少。然而在高的稀釋率下，雖然死細胞和細胞碎片及時(shí)清除，細胞活性高最終細胞密度得到提高;可是產(chǎn)物卻不斷在稀釋?zhuān)�因而產(chǎn)物濃度并為提高;尤其是細胞和產(chǎn)物不斷的稀釋?zhuān)瑺I(yíng)養物質(zhì)利用率、細胞增長(cháng)速率和產(chǎn)物生產(chǎn)速率低下。

　　3.連續式培養不足：

　　●由于是開(kāi)放式操作，加上培養周期較長(cháng)，容易造成污染;

　　●在長(cháng)周期的連續培養中，細胞的生長(cháng)特性以及分泌產(chǎn)物容易變異;

　　●對設備、儀器的控制技術(shù)要求較高。 連續式培養操作使用的反應器多數是攪拌式生物反應器，也可以是管式反應器。

　　4.連續式培養的特點(diǎn)：

　　●細胞維持持續指數增長(cháng);

　　●產(chǎn)物體積不斷增長(cháng);

　　●可控制衰退期與下降期。

　　灌流式培養

　　1. 灌流式培養是把細胞和培養基一起加入反應器后，在細胞增長(cháng)和產(chǎn)物形成過(guò)程中，不斷地將部分條件培養基取出，同時(shí)又連續不斷地灌注新的培養基。它與半連續式操作的不同之處在于取出部分條件培養基時(shí)，絕大部分細胞均保留在反應器內，而半連續培養在取培養物時(shí)同時(shí)也取出了部分細胞。 灌流式培養常使用的生物反應器主要有兩種形式。一種是用攪拌式生物反應器懸浮培養細胞，這種反應器必須具有細胞截流裝置，細胞截留系統開(kāi)始多采用微孔膜過(guò)濾或旋轉膜系統，最近開(kāi)發(fā)的有各種形式的沉降系統或透析系統。 中空纖維生物反應器是連續灌流操作常用的一種。它采用的中空纖維半透膜，透過(guò)小分子量的產(chǎn)物和底物，截流細胞和分子量較大的產(chǎn)物，在連續灌流過(guò)程中將絕大部分細胞截留在反應器內;近年來(lái)中空纖維生物反應器被廣泛應用于產(chǎn)物分泌性動(dòng)物細胞的生產(chǎn)，主要用于培養雜交瘤細胞生產(chǎn)單克隆抗體。 另外一種形式是固定床或流化床生物反應器，固定床是在反應器中裝配固定的籃筐，中間裝填聚脂纖維載體，細胞可附著(zhù)在載體上生長(cháng)，也可固定在載體纖維之間，靠上攪拌中產(chǎn)生的負壓，迫使培養基不斷流經(jīng)填料，有利于營(yíng)養成分和氧的傳遞，這種形式的灌流速度較大，細胞在載體中高密度生長(cháng)。流化床生物反應器是通過(guò)流體的上升運動(dòng)使固體顆粒維持在懸浮狀態(tài)進(jìn)行反應，適合于固定化細胞的培養。

　　2.灌流式培養的優(yōu)點(diǎn)：

　　●細胞截流系統可使細胞或酶保留在反應器內，維持較高的細胞密度，一般可達107-109/ml，從而較大的提高了產(chǎn)品的產(chǎn)量;

　　●連續灌流系統，使細胞穩定的處在較好的的營(yíng)養環(huán)境中，有害代謝廢物濃度積累較低;

　　●反應速率容易控制，培養周期較長(cháng)，可提高生產(chǎn)率，目標產(chǎn)品回收率高;

　　● 產(chǎn)品在罐內停留時(shí)間短，可及時(shí)回收到低溫下保存，有利于保持產(chǎn)品的活性。 連續灌注培養是近年用于動(dòng)物細胞培養生產(chǎn)分泌型重組治療性藥物和嵌合抗體及人源化抗體等基因工程抗體較為推崇的一種方式。應用連續灌流工藝的公司有 Genzyme, Genetic Institute, Bayer公司等。這種方法最大困難是污染機率較高，長(cháng)期培養中細胞分泌產(chǎn)品的穩定性，規模放大過(guò)程中工程問(wèn)題。

　　細胞工廠(chǎng)培養

　　細胞工廠(chǎng)(cell factory)是一種設計精巧的細胞培養裝置。它在有限的空間內利用了最大限度的培養表面，從而節省了大量的廠(chǎng)房空間,并可節省貴重的培養液。更重要的是，它可有效地保證操作的無(wú)菌性，從而避免因污染而帶來(lái)的原料、勞務(wù)和時(shí)間損失。它是對傳統轉瓶培養的革命。 丹麥NUNC公司生產(chǎn)的NUNC細胞工廠(chǎng)是目前應用較多的細胞工廠(chǎng)系統�？捎糜谌缫呙�、單克隆抗體或生物制藥等工業(yè)規模生產(chǎn)，特別適合于貼壁細胞，也可用于懸浮培養，在從實(shí)驗室規模進(jìn)行放大時(shí)不會(huì )改變細胞生長(cháng)的動(dòng)力學(xué)條件，可提供1，2，10和40盤(pán)的規格使放大變得簡(jiǎn)單易行，低污染風(fēng)險，節省空間，培養表面經(jīng)測試保證最有利于細胞貼附和生長(cháng)。同時(shí)，與NUNC的細胞工廠(chǎng)操作儀結合使用，可全面實(shí)現細胞培養的自動(dòng)化，從而大大地減低勞動(dòng)強度和密集度。 這套系統使用很方便，可產(chǎn)生類(lèi)似塑料培養瓶的效果。由組織培養級聚笨乙烯制成，使用后可隨意處理。其最大缺點(diǎn)是：經(jīng)胰酶消化后，很難將細胞完全洗出。