抗體的選擇和保存指南

　　抗體的選擇和保存指南:

　　當我們要檢測目的蛋白在組織中表達情況的時(shí)候，如何選擇適合我們實(shí)驗需要的抗體，并恰當保存使用，是每個(gè)科研人員需要細心考慮的�？贵w種類(lèi)繁多，品牌眾多，技術(shù)參數不一，價(jià)格和質(zhì)量更是相差甚大，如何購買(mǎi)到高質(zhì)量?jì)r(jià)格合適的抗體，并準確地做出我們想要的結果，其中有很多細節需要注意。

　　一、怎樣選擇適合你實(shí)驗需要的抗體

　　1. 一抗選擇要點(diǎn)

　　(1)確定抗體的名字，注意中英文名字、它名、亞型等信息。

　　(2)確定你的實(shí)驗類(lèi)型，Elisa，WB，IHC，ICC，還是FACS。一般抗體的說(shuō)明書(shū)都會(huì )列出該抗體經(jīng)驗證過(guò)適用于何種實(shí)驗的類(lèi)型，如果抗體說(shuō)明書(shū)沒(méi)有提及的應用類(lèi)型，并不意味著(zhù)該抗體不適用于此種分析應用類(lèi)型，而僅是說(shuō)明尚未經(jīng)過(guò)此種實(shí)驗驗證，請根據說(shuō)明書(shū)列出的已驗證的類(lèi)型來(lái)選擇適合你實(shí)驗的抗體。

　　(3)確定實(shí)驗樣本的種屬，Human，Mouse，還是Rat。一般抗體說(shuō)明書(shū)都列出該抗體經(jīng)試驗驗證過(guò)適用于何種物種實(shí)驗，請根據說(shuō)明書(shū)列出已驗證的種屬來(lái)選擇適合你實(shí)驗的抗體。

　　(4)樣本蛋白的結構性質(zhì)。了解樣本蛋白的結構性質(zhì)有助于選擇最合適的抗體，待測樣本蛋白的結構域和樣本在提取和處理過(guò)程中是否會(huì )變性，蛋白空間構象的改變，會(huì )影響抗體的免疫親和反應。

　　(5)單多克隆抗體的選擇。市面上的抗體還是以多克隆抗體為主，一般單克隆抗體特異性強，但親和力相對小，檢測抗原靈敏度相對就低;而多克隆抗體特異性稍弱，但抗體的親和力強，靈敏度高，但易出現非特異性染色(可以通過(guò)封閉等避免)。

　　2. 二抗選擇要點(diǎn)

　　(1)種屬來(lái)源。主要根據一抗種屬來(lái)源來(lái)決定購買(mǎi)二抗來(lái)源，如一抗是小鼠來(lái)源，那二抗就買(mǎi)抗小鼠的即可(羊、兔等均可)。

　　(2)標記物的選擇。有HRP、Biotin、熒光素等標記物。一般SP三步法二抗選擇Biotin標記的二抗，以與后面的SP結合反應，而免疫熒光染色就需要購買(mǎi)不同熒光素標記的二抗，如羅丹明、FITC、Cy3等常用熒光素。

　　二、抗體的穩定性

　　1. 抗體的穩定性是自然界長(cháng)期進(jìn)化的結果�？贵w是免疫系統中最重要的分子之一，其穩定性是自然進(jìn)化篩選的結果。在眾多物種中，抗體分子形成了保守而穩定的結構。

　　2. 抗體分子的高Tm值。在室溫下，甚至短時(shí)間溫度達到50-60℃，抗體分子都能維持正確折疊，保持應有的活性。

　　3. 抗體的純度。采用先進(jìn)的抗體純化技術(shù)，確�？贵w產(chǎn)品的高純度，保障其抗體產(chǎn)品的穩定性。

　　4. 抗體的濃度。高濃度的抗體產(chǎn)品可減少容器表面吸附造成的物質(zhì)損失，高濃度的抗體穩定性更好，抗體產(chǎn)品中93%的濃度大于0.5mg/ml。

　　三、怎樣確定抗體購買(mǎi)渠道和品牌

　　國外著(zhù)名抗體品牌的質(zhì)量一般沒(méi)問(wèn)題，但價(jià)格較貴，而且很多抗體品牌本身不生產(chǎn)抗體，隨著(zhù)網(wǎng)絡(luò )技術(shù)的越來(lái)越普及，我們自己就可以通過(guò)國內外的相關(guān)網(wǎng)站來(lái)檢索，國外最大的生物試劑查詢(xún)網(wǎng)站：biocompare，國內最大的生物試劑查詢(xún)網(wǎng)站：丁香通，來(lái)查找我們所需要的產(chǎn)品資料。

　　四、怎樣保存已獲得的抗體

　　抗體無(wú)論是保存還是運輸都應盡可能地避免反復凍融，收到抗體后請根據實(shí)驗的需要，對抗體進(jìn)行分裝，避免同一管抗體反復凍融(反復凍融會(huì )導致抗體空間結構變性，導致多聚體形成，從而降低抗體的結合能力)�？贵w保存得當與否，直接決定了抗體的活性和使用效果，如果抗體保存得當，抗體活性大部分都可以維持數年。請謹記，無(wú)論何時(shí)請按照說(shuō)明書(shū)推薦的保存條件正確處理和保存抗體。

　　1. 收到抗體后，請務(wù)必在4℃，12000rpm，離心3分鐘，(無(wú)論是液體還是凍干粉狀態(tài))，再打開(kāi)管蓋進(jìn)行分裝和保存(如果抗體體積小于50ul，請延長(cháng)離心時(shí)間至5分鐘，以保證全部抗體均離心下來(lái))�？贵w一般使用特制的儲存管，只有在12000rpm離心3分鐘，才能將附著(zhù)在管壁或蓋內的抗體全部離心下來(lái)(即使是在10000rpm離心也會(huì )離心不完全，導致出現抗體的量不足的現象)。

　　2.

　　(1)對絕大多數抗體來(lái)說(shuō)，保存在-20℃就完全足夠了，沒(méi)有任何證據顯示保存在-80℃會(huì )更好。

　　(2)分裝可以最大程度的降低反復凍融對抗體活性的損害，同時(shí)也降低了由于多次從同一管中吸取抗體造成的污染可能性。

　　(3)分裝的量以一次實(shí)驗用完為好，最少不能少于10ul每份。因為分裝體積越小，抗體的濃度越可能會(huì )受到蒸發(fā)以及管壁吸附的影響。

　　(4)復融后的分裝抗體如果一次用不完，將剩余母液保存在4℃，避免再凍起來(lái)。

　　(5)抗體工作液應該當天配制當天用完，4℃保存盡量不要超過(guò)1天。

　　(6)絕對避免將抗體保存在自動(dòng)除霜冰箱中，將抗體保存在冰箱里層，避免溫度變化造成反復凍融。

　　3. 大部分抗體收到后4℃短暫保存1~2周對抗體活性沒(méi)有影響。

　　4. 大部分抗體的運輸條件：一般的運輸過(guò)程需要1~2周的時(shí)間，所以是在低溫4℃的條件下來(lái)完成的。

　　4℃運輸最主要的目的是為了避免反復凍融對抗體活性的損害(如果使用干冰運輸，那么收到時(shí)抗體是凍起來(lái)的，為了分裝就需要解凍，這就多了一次凍融的過(guò)程)，所以運輸過(guò)程中絕對避免干冰運輸。

　　關(guān)于疊氮化鈉(sodium azide)的使用：

　　為了防止微生物污染，疊氮化鈉經(jīng)常被加入到抗體中(終濃度0.02% (w/v))。

　　注：疊氮化鈉的去除方式

　　可以通過(guò)凝膠電泳或過(guò)濾的方式去除，IgG的分子量是150kDa(IgM約600kDa);疊氮化鈉的分子量只有65Da，使用截留分子量為14kDa的濾膜即可將疊氮化鈉從抗體中去除。