質(zhì)粒DNA的分離、純化

　　所有分離質(zhì)粒DNA的方法都包括三個(gè)基本步驟：培養細菌使質(zhì)粒擴增;收集和裂解細菌;分離和純化質(zhì)粒DNA。

　　1、堿裂解法原理:本實(shí)驗采用 堿裂解法 進(jìn)行質(zhì)粒的小量制備。十二烷基磺酸鈉( SDS SDS)是一種陰離子表面活性劑，它既能使細菌細胞裂解，又能使一些蛋白質(zhì)變性。

　　用SDS 處理細菌后，會(huì )導致細菌細胞破裂，釋放出質(zhì)粒DNA 和染色體 DNA 。兩種 DNA 在強堿環(huán)境都會(huì )變性。

　　當加入 pH4.8 的酸性乙酸鉀降低溶液 pH 值后，質(zhì)粒 DNA 將迅速復性，而染色體 DNA 分子巨大，難以復性。

　　通過(guò)離心，大部分細胞碎片、染色體 DNA 、RNA 及蛋白質(zhì)沉淀( SDS 的作用下 )除去，而質(zhì)粒 DNA 留在上清中 。

　　再用異丙醇沉淀、乙醇洗滌，可得到純化的質(zhì)粒 DNA 。

　　2、實(shí)驗材料、主要儀器和試劑

　　(1)材料：含有質(zhì)粒PBLG的大腸桿菌DH5α

　　(2)儀器：塑料離心管架(30孔);10、100、1000μL微量加樣器;1.5mL塑料離心管(又稱(chēng)EPPendorf離心管);低溫高速離心機(20 000 r/min)一臺;無(wú)菌工作臺;高壓鍋;常用玻璃儀器及滴管等。

　　(3)試劑：LB培養基成分如下：每升含有胰蛋白陳10g，酵母提取物5g，NaCI10g，瓊脂糖或瓊脂(固體培養基時(shí)用)15g，用NaOH調pH至7.0;pH8.0 GET緩沖液(50mmol葡萄糖，10mmol/L EDTA，25 mmol/L Tris-HCl);0.2mol/L NaOH(內含1%的SDS)，注：臨用時(shí)配;pH4.8乙酸鉀溶液(60mL 5mol/L KAc，11.5mL冰醋酸，28.5mL H2O)：該溶液鉀離子濃度為3mol/L，醋酸根離子濃度為5mol/L;異丙醇;70%乙醇;pH8.0 TE緩沖液：10 mmol/LTris-HCI，lmmol/L EDTA，其中含RNA酶20ug/mL。

　　3、操作步驟

　　1)培養細菌將大腸桿菌PBLG接種在LB固體培養基上，37℃培養12h，挑一個(gè)菌斑接種在液體LB培養基上，37℃培養12～16h。

　　2)從菌落中快速提取制備質(zhì)粒DNA

　　(1)在無(wú)菌工作臺上取1.5mL菌液加入EPPendorf離心管中，轉速10000r/min，離心lmin，去掉上清液(注意，一定要吸干上清液)。加入150μlGET緩沖液，充分混勻，在室溫下放置10min。

　　注：溶菌酶在堿性條件下不穩定，必須在使用時(shí)新配制溶液。使用EDTA是為了去除細胞壁上的Ca2+，使溶菌酶更易與細胞壁接觸。

　　(2)加入200μl新配制的0.2mol/LNaOH(內含1%SDS)。加蓋，顛倒2～3次，使之混勻，冰上放置5min。

　　注：SDS能使細胞膜裂解，并使蛋白質(zhì)變性。

　　(3)加入150μl冰冷的乙酸鉀溶液(pH4.8)。加蓋后顛倒數次使混勻，冰上放置3-5min。

　　(4)用低溫高速離心機，轉速為10000r/min，離心5min，上清液倒入另一干凈的離心管中。

　　注：乙酸鉀能沉淀SDS和SDS與蛋白質(zhì)的復合物，在冰上放置5min是為了沉淀完全。如果上清液經(jīng)離心后仍混濁，應混勻后再冷卻至0℃重新離心。

　　(5)另取一個(gè)Eppendorf管，轉入上清，并加等體積異丙醇，混勻，室溫放置5min，12000r/min離心5min，棄去上清液。

　　(6)加入200μl無(wú)菌蒸餾水溶解沉淀，再加入1/2體積7.5mol/L NH4Ac，混勻后冰浴3～5min，以12000r/min離心5min。

　　(7)轉移上清至新管中，并加入等體積異丙醇或2倍體積無(wú)水乙醇，室溫放置5min后以12000r/min離心30min。棄去上清。

　　(8)沉淀用70%乙醇洗滌一次，小管倒置于吸水紙上，除盡乙醇，室溫自然干燥。

　　(9)加入20μlTE，使DNA充分溶解，置-20℃貯存,待用。