免疫組化問(wèn)題解答

　　免疫組化問(wèn)題解答

　　1 染色過(guò)強

　　原因 解決方法

　　a 抗體濃度過(guò)高或孵育時(shí)間過(guò)長(cháng) 降低抗體滴度、抗體孵育時(shí)間：室溫1小時(shí)或4度過(guò)夜

　　b 孵育溫度過(guò)高超過(guò)37度 一般在室溫20-28度

　　c DAB顯色時(shí)間過(guò)長(cháng)或濃度過(guò)高 顯色時(shí)間不超過(guò)5-12分鐘，以顯微鏡下觀(guān)察為準

　　2 非特異性背景染色

　　原因 解決方法

　　a 操作過(guò)程中沖洗不充分 每步?jīng)_洗3次每次5分鐘

　　b 組織中含過(guò)氧化物酶未阻斷 可再配置新鮮3%H2O2封閉孵育時(shí)間延長(cháng)

　　c 組織中含內原性生物素 正常非免疫動(dòng)物血清再封閉

　　d 血清蛋白封閉不充分 延長(cháng)血清蛋白封閉時(shí)間

　　3 染色弱

　　原因 解決方法

　　a 抗體濃度過(guò)低、孵育時(shí)間過(guò)短 提高抗體濃度、孵育時(shí)間不能少 于60分鐘

　　b 試劑超過(guò)有效使用時(shí)間 應更換試劑

　　c 操作中添加試劑時(shí)緩沖液未瀝干 每步滴加試劑前瀝干切片中多余的緩沖液

　　使試劑稀釋 (應防止切片干燥)

　　d 室溫太低 低于15度 要改放在37度孵育箱孵育30-60分鐘或4 度冰箱過(guò)夜

　　e 蛋白封閉過(guò)度 封閉不要超過(guò)12分鐘

　　4 染色陰性

　　原因 解決方法

　　a 操作步驟錯誤 應重試 設陽(yáng)性對照

　　b 組織中無(wú)抗原 設陽(yáng)性對照以驗證試驗結果

　　c 一抗與二抗種屬連接錯誤 仔細確定一抗二抗種屬無(wú)誤