動(dòng)物細胞培養：細胞凍存與復蘇

　　細胞凍存是細胞保存的主要方法之一。利用凍存技術(shù)將細胞置于一196~C液氮中低溫保存，可以使細胞暫時(shí)脫離生長(cháng)狀態(tài)而將其細胞特性保存起來(lái)，這樣在需要的時(shí)候再復蘇細胞用于實(shí)驗。而且適度地保存一定量的細胞，可以防止因正在培養的細胞被污染或其他意外事件而使細胞丟種，起到了細胞保種的作用。除此之外，還可以利用細胞凍存的形式來(lái)購買(mǎi)、寄贈、交換和運送某些細胞。 細胞凍存時(shí)向培養基中加入保護劑--終濃度5%.15%的甘油或二甲基亞砜(DMSO)，可使溶液冰點(diǎn)降低，加之在緩慢凍結條件下，細胞內水分透出，減少了冰晶形成，從而避免細胞損傷。 采用"慢凍快融"的方法能較好地保證細胞存活。標準冷凍速度開(kāi)始為-1 到 -2℃/min，當溫度低于-25℃時(shí)可加速，到-80℃之后可直接投入液氮內(-196℃)。復蘇細胞時(shí)則直接將裝有細胞的凍存管投入40℃熱水中迅速解凍。

　　材料：凍存管，離心管，細胞培養用材料，500 mL燒杯，膠布，搪瓷杯，75%酒精棉。

　　藥品：培養基(RPMI1640或DMEM)，小牛血清，0.25%胰蛋白酶溶液，二甲基亞砜(DMSO)或甘油，0.5%臺盼藍染液，液氮。

　　儀器：4℃冰箱，-70℃冰箱，液氮容器，微量加樣器，水浴鍋，離心機。

　　(一)細胞凍存

　　1.取待凍存的細胞用胰酶消化(見(jiàn)相關(guān)實(shí)驗細胞傳代培養部分)，用培養基將細胞沖洗下來(lái)。800 r/min離心5 min，棄上清收集細胞。如果是懸浮生長(cháng)的細胞，則可直接離心收集細胞。

　　2.加入適量?jì)龃嬉?10%甘油+90%培養基，或者10%DMSO+90%培養基)制成細胞懸液。細胞濃度宜大，3×106個(gè)/mL左右，并可適量增加牛血清濃度至20%。

　　3.細胞懸液裝入凍存管中。用膠布封裹，做好標記(寫(xiě)上細胞種類(lèi)、時(shí)間及凍存條件等)。

　　4.凍存管在4℃下存放30 min，轉放-20℃ 1.5～2 h，再轉人-70℃ 4-12 h后即可轉移到液氮內(-196℃)，注意進(jìn)行登記。

　　(二)細胞復蘇

　　1.取一搪瓷杯盛上適量自來(lái)水加熱至40℃左右。

　　2.從液氮中取出凍存管立即投人40℃水中迅速解凍。

　　3.取出凍存管，用75%酒精清潔管口，打開(kāi)。

　　4.離心去上清收集細胞，用無(wú)血清培養基洗1次，加人3 mL新鮮培養基，于小培養瓶中培養。

　　5.每日觀(guān)察細胞生長(cháng)情況，如果死細胞較多，復蘇次日應換液。待細胞長(cháng)滿(mǎn)后可進(jìn)行傳代培養。