影響細胞轉染成敗的原因分析

　　轉染是否成功的影響因素很多，如需要轉染的細胞類(lèi)型(對于困難的細胞系尤其如此)，需要被轉染的分子(DNA、RNA、寡核苷酸、蛋白質(zhì))，轉染試劑等。但無(wú)論在何種情況下，轉染的成功均取決于轉染效率、低細胞毒性以及重現性這幾個(gè)要素。

　　1、載體DNA

　　總則：對純化所得的載體進(jìn)行質(zhì)量鑒定。確定維持其正常功能的基因序列是否適合于您的細胞體系。在測定細胞體系的參數時(shí)，一定要選用一種已知具有功能的載體做對照。

　　·載體的完整性——載體是否具有功能取決于它結構的完整性。轉染效率受到質(zhì)粒制備物的超螺旋結構和舒展結構之間比例、雙螺旋斷裂、核酸酶的降解，以及來(lái)自于儲存和處理過(guò)程中的物理壓力的影響。

　　·載體制備物——各種載體是按照不同的方案在細菌體系中制備并純化。制備產(chǎn)物中殘余的污染物(如CsCl，內毒素)可能會(huì )影響轉染效率。

　　·載體構造(啟動(dòng)子/增強子/ORI)——轉染體系通常用帶有強病毒調節元件(如，RSV，CMV，和SV40)的對照載體進(jìn)行優(yōu)化和比較。然而，病毒啟動(dòng)子/增強子體系的相對有效性在不同細胞系間的差異可大到兩個(gè)數量級。例如，在某些細胞系中，由于自發(fā)的質(zhì)粒擴增，SV40體系可高效表達large T抗原(如，COS);而在其他許多細胞系中，則是CMV啟動(dòng)子更為有效。

　　除此之外，各種CMV載體的表達率也會(huì )有超過(guò)一個(gè)數量級的差異，這部分是由于載體中其他調節元件所引起的。

　　2、細胞

　　·貼壁細胞相比較懸浮細胞——在轉染效率方面貼壁細胞和懸浮細胞之間的差異顯著(zhù)。相對于貼壁細胞(如HEK，CHO)，懸浮細胞(如HL 60，Jurkat)非常難以轉染，可能是因為細胞間膜結構的差異，但目前還沒(méi)有分子水平上合理機制的解釋。

　　·分裂細胞相比較非分裂細胞——分裂細胞往往要比靜止細胞更易于攝取并表達外源DNA。因此對大多數轉染操作而言，細胞都在轉染當天或前一天種板。同樣重要的是細胞在種板進(jìn)行轉染時(shí)不應處于過(guò)度生長(cháng)的狀態(tài);此外，還常用促有絲分裂刺激物(如，病毒轉化，生長(cháng)因子，條件培養基，以及滋養細胞)來(lái)活化原代培養細胞。

　　·分板方案——在對培養細胞進(jìn)行分板傳代培養之前，必須把貼壁細胞用胰蛋白酶消化使之脫離培養基質(zhì)。這個(gè)常規操作可導致正常細胞功能受到嚴重損害。因此分批方案的不同(如，胰蛋白酶消化時(shí)間的長(cháng)短，胰蛋白酶的滅活等)需要優(yōu)化。

　　·傳代次數——傳代次數是指對一個(gè)細胞系進(jìn)行分批傳代的頻度(通常在一個(gè)實(shí)驗室范圍內)。某些細胞系相比較其他細胞系而言較不穩定，可能會(huì )隨著(zhù)培養時(shí)間的延長(cháng)而改變，視不同的細胞系和培養條件而定。因此名稱(chēng)相同的同一細胞系在生理學(xué)和形態(tài)學(xué)(以及轉染能力)性質(zhì)也可能會(huì )有很大的差異。一般而言，細胞在凍存復蘇后的一兩代之內或直到它們完全復蘇之前都很難轉染。

　　·細胞數量(融合率)——只要培養基質(zhì)(組織培養皿)尚有空間，細胞就會(huì )按指數規律分裂。對于正常細胞而言，細胞生長(cháng)的速度受細胞密度大小的抑制(接觸抑制)，但癌細胞則不受此限制而會(huì )繼續生長(cháng)并可互相疊加。營(yíng)養物質(zhì)的耗竭以及代謝廢物的積聚會(huì )影響所有的細胞生長(cháng)。細胞會(huì )因受到營(yíng)養物質(zhì)匱乏的壓力而不適于轉染。報告基因的表達率與轉染開(kāi)始時(shí)的細胞數量和細胞健康以及細胞溶解之前的生長(cháng)情況相關(guān)。

　　·培養物污染——培養物可被細菌、酵母、真菌、病毒、支原體、甚至其他細胞種類(lèi)所污染。各種污染都會(huì )導致產(chǎn)生錯誤的結果。

　　·支原體污染——支原體污染在所有培養細胞中的比例為5-35%，它可改變細胞生長(cháng)特性，酶的作用途徑，細胞膜的組成，染色體結構，以及轉染效率。特別是，支原體對采用脂質(zhì)、DEAE-右旋糖酐、磷酸鈣或腺病毒介導的轉染技術(shù)有所干擾，其結果致使非典型轉染或轉染效率偏低。這些影響會(huì )導致實(shí)驗結果的不可靠以及時(shí)間和珍貴細胞系的損失。和細菌及真菌不同，支原體污染無(wú)法通過(guò)視覺(jué)檢查發(fā)現。它們非常小甚至能夠通過(guò)大多數的無(wú)菌濾膜;它們還對常用抗生素有抗藥性。所以必需進(jìn)行支原體污染的常規篩查。

　　3、交叉污染

　　如果同一個(gè)實(shí)驗室同時(shí)培養不同種類(lèi)的細胞，那就有可能發(fā)生交叉污染，即使遵循最嚴格的分離操作規程這種情況也有可能發(fā)生。如有許多細胞系被HeLa細胞所污染。和其他細胞系之間的交叉污染不總是能通過(guò)鏡檢發(fā)現。如果有少量某種生長(cháng)快速的細胞摻入到培養細胞種，幾個(gè)月過(guò)后它們就會(huì )完全取代目標培養物。

　　4、組織培養試劑

　　一般原則：優(yōu)化您的細胞生長(cháng)條件。只使用新鮮配制的培養基和添加劑，并盡可能減少所用試劑的變更。

　　·基礎培養基——培養基的成分包括營(yíng)養物質(zhì)(氨基酸，葡萄糖)，維生素，無(wú)機鹽，和緩沖物質(zhì)。有些成分非常不穩定，因此如果在使用時(shí)不是新鮮，加入就可能會(huì )產(chǎn)生問(wèn)題。配置時(shí)要使培養基務(wù)必避光保存;因為已知有一些組分和緩沖物質(zhì)，如HEPES，當暴露于光照下就會(huì )分解產(chǎn)生細胞毒性物質(zhì)。

　　·胎牛血清——血清是一種含有白蛋白、球蛋白、生長(cháng)促進(jìn)因子和生長(cháng)抑制因子的極為復雜的混和物。采集血清所用動(dòng)物的年齡、營(yíng)養水平和健康狀況可影響到血清中這些成分的數量和質(zhì)量，從而引起顯著(zhù)生物學(xué)變化。

　　·添加劑——某些細胞的生長(cháng)依賴(lài)于一些對生命力或細胞分裂必不可少的物質(zhì)(如，生長(cháng)因子，微量元素，必需代謝物和蛋白等)。

　　·CO2培養箱——細胞生長(cháng)所需環(huán)境為37℃、相對濕度為95%的CO2培養箱。用CO2是為了控制pH值，細胞生理對pH的變化非常敏感，因此多數細胞培養基都含有碳酸氫鹽緩沖體系。有些培養基需要CO2 濃度為5%來(lái)有效控制pH值，而另一些則需要10%的CO2。需要向您的培養基供應者核對一下適當的CO2濃度。如果培養箱內培養條件與所需條件不一致(溫度、濕度和CO2)則會(huì )導致實(shí)驗結果的板間變異。來(lái)自于培養箱內的污染物、化學(xué)物質(zhì)，或真菌/細胞的污染也都可能影響到細胞生理。

　　5、瞬時(shí)轉染和穩定轉染

　　制備一種穩定細胞系的第一步是選擇一種同時(shí)含有選擇性標記物和目的基因的載體。選擇性標記物通常是可以產(chǎn)生一種蛋白質(zhì)或者酶來(lái)幫助細胞在某些毒性物質(zhì)存在下存活的基因。

　　一旦選好了質(zhì)粒載體，無(wú)論瞬時(shí)或者穩定表達都采用一樣的轉染方法。在加入選擇性試劑之前，被轉染的細胞至少要在標準培養基中培養過(guò)夜。這樣就使細胞有時(shí)間表達足量的蛋白使之能夠耐受選擇性試劑的作用。細胞于是在加有選擇性試劑的培養基中生長(cháng)。那些未成功轉染質(zhì)粒的細胞即被殺死。而只有那些成功轉染的細胞能夠生長(cháng)。有的時(shí)候，還可以將選擇性試劑持續加入到培養基中，以維持對細胞的選擇壓力。

　　6、轉染方案

　　一般原則：建立一套適當的轉染方案;首先從一種標準方案開(kāi)始，然后通過(guò)改變試劑/DNA的配比和復合物的劑量進(jìn)行優(yōu)化。

　　·轉染復合物的制備——諸如轉染試劑/DNA配比，離子強度，緩沖液pH值，以及溫度等變量都會(huì )影響到轉染復合物的組成和功能。質(zhì)�？捎脽o(wú)菌水或TE緩沖液稀釋。如果您要使用一種市售的轉染試劑，就應當仔細閱讀該試劑所提供的使用說(shuō)明。在不含血清或其他蛋白的培養基中制備轉染復合物;如果制備復合物所使用的培養基含有血清，它就會(huì )對轉染產(chǎn)生抑制。制備轉染復合物的最佳孵育時(shí)間是一個(gè)非常關(guān)鍵的環(huán)節，對于不同的轉染試劑而言可能差別很大。

　　轉染試劑/DNA配比(負載比)——所有的轉染試劑都會(huì )在某一個(gè)試劑/DNA配比時(shí)最有效。有時(shí)候這種最佳配比的所在范圍非常狹窄;對于每種實(shí)驗體系都必須進(jìn)行優(yōu)化才能得到最佳配比。