細胞培養中死活細胞測定

　　細胞培養過(guò)程中需要測定細胞的存活率以了解細胞的生長(cháng)狀態(tài)，鑒定細胞存活常用的方法有染色法和儀器分析法。染色法可直接通過(guò)細胞形態(tài)，區別細胞死亡，它是一種簡(jiǎn)單的細胞存活鑒定方法。

　　【實(shí)驗原理】

　　(一)染色法是常用的細胞死活鑒定方法，簡(jiǎn)便，易于操作。實(shí)驗是利用了死活細胞在生理機能和性質(zhì)上的差異來(lái)進(jìn)行的。死活細胞在生理機能和性質(zhì)上的差異主要體現在：

　　(1)死活細胞細胞膜通透性的差異：活細胞的細胞膜是一種選擇性膜，對細胞起保護和屏障作用，只允許物質(zhì)選擇性的通過(guò);而細胞死亡之后，細胞膜受損，通透性增加。

　　(2)死活細胞在代謝上的差異：由于活細胞中新陳代謝的作用，使細胞內具有較強的還原能力，而死細胞或代謝緩慢的老細胞，則因它們的無(wú)還原能力或還原能力極弱。

　　常見(jiàn)的細胞染料有：中性紅(細胞器的專(zhuān)有染料)、臺盼藍、甲基藍、美藍、熒光素雙醋酸酯(FDA)等。

　�、� 中性紅染色：常用染料之一，是細胞器的專(zhuān)有染料。利用細胞膜的通透性差異，用來(lái)染原生動(dòng)物和顯示動(dòng)植物組織中活細胞的內含物等。中性紅無(wú)毒，常做活體染色的染料。

　�、� 臺盼藍染色：當細胞損傷或死亡時(shí)，臺盼藍可穿透變性的細胞膜，與解體的DNA 結合，使其著(zhù)色。而活細胞能阻止染料進(jìn)入細胞內。故可以鑒別死細胞與活細胞。嚴格來(lái)說(shuō)，臺盼藍染色檢測的是細胞膜的完整性，通常認為細胞膜喪失完整性，即可認為細胞已經(jīng)死亡。通過(guò)顯微鏡很容易就能識別出死亡的被臺盼藍染色的細胞，并可使用細胞計數器進(jìn)行計數。

　�、� 美藍染色法：美藍是一種無(wú)毒性染料，它的氧化型是藍色的，而還原型是無(wú)色的，用它來(lái)對活細胞進(jìn)行染色，由于細胞中新陳代謝的作用，使細胞內具有較強的還原能力，能使美藍從藍色的氧化型變?yōu)闊o(wú)色的還原型，所以活細胞無(wú)色，而對于死細胞或代謝緩慢的老細胞，則因它們無(wú)此還原能力或還原能力極弱，而被美藍染成藍色或淡藍色。因此，用美藍水浸片不僅可觀(guān)察酵母的形態(tài)，還可以區分死、活細胞.

　�、� 甲基藍染色法：甲基藍染色與臺盼藍類(lèi)似的染色機理。

　　(二)植物細胞質(zhì)壁分離法及活體染色測定細胞死活

　　(1)質(zhì)壁分離法：成長(cháng)的植物細胞一般具有中央液泡，在中央液泡和細胞壁之間為細胞質(zhì)的薄層及其內外膜——液泡膜和質(zhì)膜。液泡中的胞液具有一定的溶質(zhì)勢(或稱(chēng)滲透勢)，而活的原生質(zhì)特別是液泡膜和質(zhì)膜則具有半透性。所以，當細胞與外界溶液接觸時(shí)，便與外液構成滲透系統，并可能發(fā)生水分的移動(dòng)。若外液的水勢低于胞液的溶質(zhì)勢，則水分外滲的結果可使原生質(zhì)隨著(zhù)液泡一起收縮而脫離細胞壁，發(fā)生質(zhì)壁分離，質(zhì)壁分離的細胞與水或水勢較高的溶液接觸時(shí)，可重新吸水而是質(zhì)壁分離復原。

　　(2)活體染色法：活體染色是利用某種對植物無(wú)害的染料稀溶液對活細胞進(jìn)行染色技術(shù)。中性紅是常用的染料之一，它是一種弱堿性pH6.4～8.0之間(由紅變黃)，在中性或微堿性環(huán)境中，植物的活細胞能大量吸收中性紅并向液泡中排泌，由于液泡在一般情況下呈酸性反應，因此，進(jìn)入液泡的中性紅便解離出大量陽(yáng)離子而呈現桃紅色。在這種情況下，原生質(zhì)和細胞壁一般不著(zhù)色。死細胞由于原生質(zhì)變性凝固，胞液不能維持在液泡內，因此，用中性紅染色后，不產(chǎn)生液泡著(zhù)色現象，相反，中性紅的陽(yáng)離子卻與帶有一定負電荷的原生質(zhì)及細胞核結合，而使原生質(zhì)與細胞核染色。