熒光素標記抗體技術(shù)

　　(一) 原理

　　目前用于抗體標記的熒光素主要有異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocynate,FITC)或羅達明(Lis

　　samine rhodamine B200, RB200)。在鹼性條件下 FITC 的碳酰胺鍵可與抗體賴(lài)氨酸的ε氨基共價(jià)結合，標

　　記后的抗體仍保持與相應抗原結合的能力。在熒光燈源紫外線(xiàn)或蘭紫光激發(fā)下產(chǎn)生黃綠色熒光，通過(guò)在熒

　　光顯微鏡下觀(guān)察或流式細胞儀分析可對相應抗原進(jìn)行定性、定位或定量的檢測。

　　(二) 操作步驟

　　將純化的 IgG 抗體對 PH9～9.5 碳酸鹽緩沖液透析過(guò)夜，

　　透析后抗體液移入小燒杯中

　　↓

　　稱(chēng)取適量 IFTC，加入二甲亞砜(DMSO)(FITC～1mg/1ml DMSO) 使終濃度為 1mgFITC/1mlDMSO

　　FITC/IgG 比例:如 IgG 濃度為 1mg/ml，FITC/IgG 比例約為 50μgFITC/mgIgG;

　　如 IgG 為 5～10mg/ml，則比例為 25μgFITC/ml IgG 在 10ml 小燒杯中先放入抗體

　　↓

　　按上述比例將 FITC-DMSO 溶液逐滴加入透析后的抗體溶液中

　　↓

　　將標記物用 PBS 加至 2.5ml，磁力攪拌器室溫下避光攪拌 2h ↓

　　用 PD10 柱(Sephadex G25 柱)除去游離熒光素，先用 25ml PBS 淋洗 G25 柱

　　↓

　　收集 PBS 洗脫第一個(gè)熒光素結合蛋白峰，測定 F/P 比值。第二個(gè)熒光素峰為游離熒光素

　　計算:

　　2.87×A495

　　F/P=────────

　　A280-0.35×A495 合適的 F/P 值為 2～4。

　　(三) 試劑器材

　　1. 純化的多克隆抗體或單克隆抗體。

　　2. FITC(Fluorescein-5-Lsothiocyanalte)或其它熒光色素。

　　3. PBS、DMSO4. PH9～9.5 碳酸鹽緩沖液: Na2CO34.3g，NaHCO3 8.6g 加蒸餾水至 500ml。

　　5. PD10 柱(Sephadex G25 柱)

　　6. 磁力攪拌器，紫外分光光度計等

　　(四) 注意事項

　　1. FITC 保存于 4℃暗處，使用前待試劑瓶升至室溫時(shí)開(kāi)蓋稱(chēng)取，以避免潮解。

　　2. FITC-DMSO 液要臨用時(shí)配制。

　　3. 碳酸鹽緩沖液要新鮮配制。