一抗的選擇與優(yōu)化

　　在設計IHC/ICC實(shí)驗時(shí)，一抗的選擇是相當重要的。IHC/ICC實(shí)驗的所有步驟都必須經(jīng)過(guò)優(yōu)化，以便觀(guān)察到特異染色，并盡可能減少非特異的背景染色。這包括開(kāi)展預實(shí)驗，以確定每個(gè)一抗的適當孵育條件�？乖�親和純化的多克隆抗體的稀釋度通常低于單克隆抗體，但這些值必須根據經(jīng)驗確定。為了獲得可靠特異的信號，應采用交叉反應性極少的高質(zhì)量抗體。

　　一抗孵育的起始條件

　　單克隆抗體多克隆抗體

　　組織5-25 µg/mL，4 °C孵育過(guò)夜1.7-15 µg/mL，4 °C孵育過(guò)夜

　　細胞5-25 µg/mL，室溫下1小時(shí)1.7-15 µg/mL，室溫下1小時(shí)

　　優(yōu)勢 單表位特異性所需濃度較低

　　限制 易受表位遮蔽的影響異質(zhì)群體

　　選擇一抗供應商

　　在搜索一抗時(shí)，產(chǎn)品很可能有幾個(gè)不同的商業(yè)來(lái)源，而它們的抗體質(zhì)量可能參差不齊。最初的選擇也許決定了這是個(gè)成功的實(shí)驗，抑或是個(gè)錯失的機會(huì )。第一步是尋找獨立驗證。這包括在文獻中檢查抗體過(guò)去是否成功使用。許多供應商(包括R&D Systems)都可以為尋找這一信息的研究人員提供協(xié)助。另一個(gè)問(wèn)題是詢(xún)問(wèn)抗體是否真的由供應商制造，還是它采購了之后轉售?直接購買(mǎi)確保了商業(yè)來(lái)源對制造、質(zhì)量控制流程、以及運輸和儲存條件的完全控制。此外，一旦抗體的使用出現問(wèn)題，制造商會(huì )處于提供優(yōu)質(zhì)技術(shù)服務(wù)的最佳地位。

　　選擇單克隆還是多克隆抗體

　　單克隆和多克隆抗體的內在特征決定了它們用于IHC/ICC時(shí)的優(yōu)勢和限制。單克隆抗體由單個(gè)B細胞克隆產(chǎn)生，代表了同質(zhì)群體，能夠高親和力高特異性地與單個(gè)表位結合。這在檢測蛋白家族的某個(gè)成員時(shí)特別有用，因為蛋白家族有著(zhù)高比例的氨基酸同源性。

　　抗體結合往往依賴(lài)于目標蛋白維持其天然的構想狀態(tài)。與其他蛋白的相互作用、翻譯后修飾、溫度、pH、固定和鹽濃度都會(huì )影響抗體接近目的表位。多克隆抗體是異質(zhì)的，可識別多個(gè)表位，因此它們較少受到蛋白構象變化的影響。一般而言，多克隆抗體在一定pH和鹽濃度范圍內也比單克隆抗體更為穩定�；�于這些原因，多克隆抗體更常用于IHC/ICC實(shí)驗。

　　多克隆抗體的親和純化

　　多克隆抗血清是抗體混合物，它們由大量B細胞克隆產(chǎn)生。組成多克隆抗血清的抗體以不同的特異性和親和力與目標表位結合，也與不相關(guān)的目標分子交叉反應(非特異相互作用)。為了富集與目的抗原特異性和親和力最高的抗體，R&D Systems的多克隆抗體經(jīng)過(guò)抗原親和純化。在此過(guò)程中，多克隆抗血清流過(guò)包含固定化抗原分子的親和柱。特異抗體被固定化抗原保留，而非特異抗體流過(guò)柱子，被丟棄。隨后從柱子上洗脫經(jīng)抗原親和純化的抗體�？乖�親和純化的抗體主要與目的抗原相互作用，降低了背景染色，與未純化抗體相比產(chǎn)生了更一致的結果。

　　一抗孵育的優(yōu)化

　　一抗濃度、稀釋液、孵育時(shí)間和溫度都影響了染色質(zhì)量。這些變量需要針對每個(gè)抗體和樣品來(lái)優(yōu)化，以便實(shí)現特異染色和低背景。優(yōu)化通常是保持孵育時(shí)間和溫度不變，而改變抗體濃度，以確定何時(shí)獲得最佳信號和低背景噪音。例如，如果使用高親和力的抗體，那么相對較高的濃度可能需要較短的孵育時(shí)間。相反，較低的抗體濃度可能需要較長(cháng)的孵育時(shí)間。人們通常采用較長(cháng)的孵育時(shí)間，以確�？贵w完全滲透到體視學(xué)技術(shù)所用的組織切片。為了促進(jìn)特異染色，較長(cháng)時(shí)間的孵育通常在低溫下開(kāi)展(即4 °C vs 室溫)。

　　R&D Systems組織切片染色方案的優(yōu)化通常是從一抗在4 °C孵育過(guò)夜開(kāi)始的。對于細胞染色，人們通常選擇在室溫下與一抗共同孵育1小時(shí)�？乖�親和純化過(guò)的多克隆抗體的工作濃度(1.7-15 µg/mL)通常比單克隆抗體(5-25 µg/mL)要低。在比較不同濃度的相同抗體染色的樣品時(shí)，在孵育步驟時(shí)必須使用一致的時(shí)間和濃度。當第一次使用新抗體時(shí)，建議開(kāi)展預實(shí)驗，檢驗各種抗體濃度。