檢測蛋白磷酸化的方法大全

　　直接測定蛋白磷酸化的一種經(jīng)典方法是將整個(gè)細胞與放射性標記的32P-磷酸鹽共同孵育，獲得細胞提取物，通過(guò)SDS-PAGE分離，并曝光在膠片上。這種繁瑣的方法需要多次幾小時(shí)的孵育，且使用放射性同位素。其他傳統方法包括2D凝膠電泳，這種技術(shù)假定磷酸化會(huì )改變蛋白的遷移率和等電點(diǎn)。

　　鑒于這些方法很費力，磷酸化依賴(lài)抗體的開(kāi)發(fā)受到研究人員的極大歡迎。1981年，第一個(gè)有記錄的磷酸化抗體在兔子中產(chǎn)生，使用的是鑰孔蟲(chóng)戚血藍蛋白(KLH)的苯甲酰磷酸結合物。這一抗體廣泛地識別了包含磷酸酪氨酸的蛋白。十年后，利用合成的磷酸化肽段來(lái)免疫兔子，開(kāi)發(fā)出多個(gè)磷酸化狀態(tài)特異抗體，這些磷酸化肽段代表了目標蛋白磷酸化位點(diǎn)周?chē)�的氨基酸序列。之后將免疫血清上樣到肽段親和柱中，產(chǎn)生高度特異的免疫試劑。磷酸化特異抗體的出現為傳統方法的改進(jìn)以及新的免疫分析技術(shù)的開(kāi)發(fā)打開(kāi)了大門(mén)。在任何技術(shù)中使用磷酸化特異抗體的忠告是，成功的檢測依賴(lài)于抗體與目的磷酸化蛋白的特異性和親和力。

　　Western Blot

　　Western blot是評估蛋白磷酸化狀態(tài)的最常用方法，大部分細胞生物學(xué)實(shí)驗室都擁有開(kāi)展這些實(shí)驗的設備。利用SDS-PAGE分離生物樣品，隨后轉移到膜上(通常是PVDF或尼龍膜)，之后利用磷酸化特異的抗體來(lái)鑒定目的蛋白。典型的Western blot實(shí)驗步驟避免了使用放射性同位素時(shí)的危險品和廢物處理要求。許多磷酸化特異抗體十分靈敏，可輕松檢測常規樣品(如10-30 µg細胞提取物)中的磷酸化蛋白。由于測得的磷酸化蛋白水平可能隨處理或凝膠上樣誤差而變化，研究人員常常利用一個(gè)抗體來(lái)檢測同源蛋白的總水平(而不考慮磷酸化狀態(tài))，以確定磷酸化組分相對于總組分的比例，并充當上樣內對照�；瘜W(xué)發(fā)光和顯色法都很常用，而分子量marker常用來(lái)提供蛋白分子量的信息。

　　酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)

　　ELISA已逐漸成為測定蛋白磷酸化的一種有力方法。ELISA的定量能力優(yōu)于Western blot，且在調節激酶活性和功能的研究中表現出巨大的作用。這種微孔板形式的分析一般利用目的蛋白特異的捕獲抗體，與磷酸化狀態(tài)無(wú)關(guān)。隨后讓目的蛋白結合在抗體包被的分析板中，目的蛋白可以是純的，也可以是復雜的異質(zhì)樣品(如細胞裂解液)中的一個(gè)組分。加入待分析的磷酸化位點(diǎn)特異的檢測抗體。這些分析通常設計為顯色或熒光檢測。產(chǎn)生的信號強度與最初樣品中存在的磷酸化蛋白的濃度成正比。與更為傳統的免疫印跡相比，磷酸化特異的ELISA技術(shù)具有一些優(yōu)點(diǎn)。首先，利用經(jīng)過(guò)校準的標準品，可輕松定量結果。其次，以三明治形式使用目的蛋白特異的兩個(gè)抗體，帶來(lái)了高的特異性。第三，ELISA的靈敏度更高允許使用更少量樣品，檢測低豐度的蛋白。最后，微孔板形式的通量比傳統的Western blotting要高得多。ELISA通常帶來(lái)了激酶活性的間接測定。不過(guò)，另一類(lèi)ELISA技術(shù)使用固定化的捕獲抗體、底物和磷酸化底物的檢測方法，帶來(lái)激酶活性的更直接測定。

　　基于細胞的ELISA

　　盡管體外生物化學(xué)激酶分析(如典型的三明治ELISA)常用于假說(shuō)檢驗和藥物篩選，但它們無(wú)法復制細胞內的環(huán)境。分析完整細胞內的蛋白磷酸化也許能更準確地代表特定信號通路網(wǎng)絡(luò )的狀態(tài)。一些免疫分析最近被開(kāi)發(fā)出來(lái)，能夠在完整細胞的背景下測定蛋白磷酸化。細胞在同一個(gè)孔中被刺激、固定和阻斷。使用磷酸化特異抗體，利用熒光或顯色檢測系統來(lái)評估磷酸化狀態(tài)。此外，在微孔板的同一個(gè)孔中同時(shí)檢測磷酸化蛋白和總蛋白。因此，來(lái)自目的蛋白的信號可通過(guò)第二種蛋白來(lái)標準化，校正各孔之間的差異，實(shí)現磷酸化蛋白水平的準確評估，并比較多個(gè)樣品，與傳統免疫印跡中使用磷酸化特異和總蛋白抗體相似。這些分析繞過(guò)了制備細胞裂解液的需要，因此更適合高通量分析。

　　細胞內流式細胞術(shù)和ICC/IHC

　　傳統的細胞內流式細胞術(shù)和免疫細胞化學(xué)/免疫組織化學(xué)(ICC/IHC)是檢測磷酸化事件的有力工具。流式細胞儀利用激光來(lái)激發(fā)用于抗體檢測的熒光染料。在評估同一個(gè)細胞中的多個(gè)蛋白時(shí)，必須精心選擇濾光片組合和熒光染料，其光譜不能重疊。流式細胞術(shù)很有優(yōu)勢，因其實(shí)現了快速、定量的單細胞分析。通過(guò)細胞表面標志的分型可檢測異質(zhì)群體中特定細胞類(lèi)型的蛋白，而無(wú)需在物理上分離細胞。通過(guò)這種方法可分析稀有的細胞群體，而不用擔心細胞損失或細胞分選過(guò)程中可能發(fā)生的蛋白表達變化。

　　ICC通常指的是利用顯微鏡對培養細胞中的蛋白進(jìn)行檢測，而IHC指的是對完整組織切片中的蛋白進(jìn)行檢測。與流式細胞術(shù)相似，這些技術(shù)實(shí)現了細胞或組織內多個(gè)蛋白的評估，只是要足夠重視，避免熒光光譜或顏色的重疊。熒光和顯色檢測技術(shù)都經(jīng)常使用。與監控磷酸化的其他形式不同，ICC通常是確定細胞內定位的首選方法。流式細胞術(shù)和ICC/IHC都需要高親和力、高特異性的抗體、阻斷步驟、對照和抗體滴定，以避免因非特異性結合而帶來(lái)的不明確結果。

　　通過(guò)流式細胞術(shù)和ICC來(lái)檢測磷酸化蛋白要求蛋白是穩定的，且抗體能夠接近。細胞通常經(jīng)過(guò)刺激，并由甲醛或多聚甲醛固定，以交聯(lián)磷酸化蛋白，使其穩定，便于分析。固定后的細胞必須經(jīng)過(guò)透化處理，讓磷酸化特異抗體可進(jìn)入細胞。對于不同的亞細胞定位，通常使用不同的透化技術(shù)。溫和的去垢劑可實(shí)現細胞質(zhì)蛋白的檢測，而抗體要想接近核蛋白，可能需要使用酒精。酒精透化也可增強磷酸化特異抗體的磷酸化蛋白檢測，因酒精具有變性的特點(diǎn)。

　　質(zhì)譜

　　復雜的生物樣品(如細胞裂解液)中蛋白質(zhì)磷酸化的全面評估(磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué))對于了解基于磷酸化的信號網(wǎng)絡(luò )很重要。復雜的蛋白混合物中大規模的磷酸化蛋白分析包括磷酸化蛋白和磷酸化肽段的鑒定，以及磷酸化殘基的測序。質(zhì)譜(MS)技術(shù)是完成這些任務(wù)的有用工具。盡管質(zhì)譜在鑒定單個(gè)蛋白上具有出色的靈敏度和分辨率，但對于磷酸化蛋白的分析，還有一些固有的困難。首先，磷酸化肽段的信號通常較弱，因為它們帶負電荷，而電噴霧質(zhì)譜在正電模式下作用，因此電離效果不好。其次，在大量非磷酸化蛋白的高背景之下，很難觀(guān)察到低豐度目的蛋白的信號。為了克服這些缺點(diǎn)，人們已經(jīng)開(kāi)發(fā)出一些富集策略，包括固定化金屬親和層析(IMAC)、磷酸化特異抗體富集、化學(xué)修飾法(如磷酸化絲氨酸和蘇氨酸的β-消去反應)，以及用生物素化的基團取代磷酸基團。

　　多個(gè)分析物圖譜分析

　　質(zhì)譜技術(shù)如碰撞誘導解離(CID)和電子轉移解離(ETD)，提供了肽段序列和翻譯后修飾(磷酸化)的全面平行分析。這些技術(shù)相當費力，而當特定通路作為主要研究目標時(shí)，可能不需要全面的磷酸化分析策略。這導致一些同時(shí)測定多個(gè)分析物的蛋白磷酸化的新方法被開(kāi)發(fā)出來(lái)�？偟膩�(lái)說(shuō)，這些方法涉及到磷酸化特異抗體的使用，包括基于微孔板、磁珠和膜，基于磁珠和基于膜的檢測形式。這些分析最明顯的好處在于通量能力被大大提高，避免了運行多個(gè)Western blot或傳統的ELISA分析的需要。這些技術(shù)也能夠提供更多的數據，而所需的樣品量極少。相應地，蛋白圖譜分析通常被認為靈敏度不及傳統的對應技術(shù)，因潛在的抗體交叉反應性。

　　結論

　　評估蛋白磷酸化往往是細胞生物學(xué)家保留曲目中必不可少的一部分，可了解引起細胞活性的細胞內因子�？紤]到激酶扮演的重要角色，研究人員必須要有優(yōu)質(zhì)的工具，才能測定蛋白磷酸化和/或激酶活性。每種技術(shù)在不同的背景下發(fā)揮優(yōu)勢，因此必須精心挑選最適合實(shí)驗設計的方法(表1)。這篇綜述簡(jiǎn)要介紹了一些評估蛋白磷酸化的最常用方法。由于需求在不斷增長(cháng)，方法也在不斷改善，讓研究人員能夠更深入地了解這些復雜而重要的過(guò)程，最終控制細胞功能。