質(zhì)粒提取常見(jiàn)問(wèn)題系統分析

　　未提出質(zhì)�；蛸|(zhì)粒得率較低：

　　△ 大腸桿菌老化

　　請涂布平板培養后，重新挑選新菌落進(jìn)行液體培養。

　　△ 質(zhì)�？截悢档�

　　由于低使用低拷貝數載體引起的質(zhì)粒DNA提取量低，可更換具有相同功能的高拷貝數載體。

　　△ 菌體中無(wú)質(zhì)粒

　　有些質(zhì)粒本身不能在某些菌種中穩定存在，經(jīng)多次轉接后有可能造成質(zhì)粒丟失。例如，柯斯質(zhì)粒在大腸桿菌中長(cháng)期保存不穩定，因此不要頻繁轉接，每次接種時(shí)應接種單菌落。另外，檢查篩選用抗生素使用濃度是否正確。

　　△ 堿裂解不充分

　　使用過(guò)多菌體培養液，會(huì )導致菌體裂解不充分，可減少菌體用量或增加溶液P1、P2和P3的用量。對低拷貝數質(zhì)粒，提取時(shí)，可加倍使用溶液P1、P2和P3，可能有助于增加質(zhì)粒提取量和質(zhì)粒質(zhì)量。

　　△ 溶液使用不當

　　溶液P2、P3在溫度較低時(shí)可能出現渾濁，應置于37℃保溫片刻直至溶解為清亮的溶液，才能使用。

　　△ 吸附柱過(guò)載

　　不同產(chǎn)品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的質(zhì)粒量很大，請分多次提取。若用富集培養基，例如TB 或2×YT，菌液體積必須減少;若質(zhì)�；蛩拗骶�是非常高的拷貝數或生長(cháng)率，則需調整LB培養液體積。

　　△ 質(zhì)粒未全部溶解(尤其質(zhì)粒較大時(shí))

　　洗脫溶解質(zhì)粒時(shí)，可適當加溫或延長(cháng)溶解時(shí)間。

　　△ 乙醇殘留

　　漂洗液洗滌后應離心盡量去除殘留液體，樹(shù)脂型試劑盒漂洗后應晾干樹(shù)脂，再加入洗脫緩沖液。

　　△ 洗脫液加入位置不正確

　　洗脫液應加在硅膠膜中心部位以確保洗脫液會(huì )完全覆蓋硅膠膜的表面達到最大洗脫效率。

　　△ 洗脫液不合適

　　DNA只在低鹽溶液中才能被洗脫，如洗脫緩沖液EB (10 mM Tris·Cl, pH 8.5)或水。洗脫效率取決于pH值。最大洗脫效率在pH7.0-8.5間。當用水洗脫時(shí)確保其pH值在此范圍內，如果pH過(guò)低可能導致洗脫量低。洗脫時(shí)將滅菌蒸餾水或洗脫緩沖液加熱至60℃后使用有利于提高洗脫效率。

　　△ 洗脫體積太小

　　洗脫體積對回收率有一定影響。隨著(zhù)洗脫體積的增大回收率增高，但產(chǎn)品濃度降低。為了得到較高的回收率可以增大洗脫體積。

　　△ 洗脫時(shí)間過(guò)短

　　洗脫時(shí)間對回收率也會(huì )有一定影響。洗脫時(shí)放置一分鐘可達到較好的效果。

　　■ 質(zhì)粒純度不高：

　　△ 混有蛋白

　　不要使用過(guò)多菌體。溶液P1、P2、P3處理并離心后溶液應為澄清的，如果還混有微小蛋白懸浮物，可再次離心去除后再進(jìn)行下一步驟。

　　△ 混有RNA

　　RNase A處理不徹底，請減少菌體用量或加入溶液P3之后室溫放置一段時(shí)間。如果溶液P1已保存6個(gè)月以上，請在溶液P1中添加RNase A。

　　△ 混有基因組DNA

　　加入溶液P2和P3后應溫和混勻，如果劇烈振蕩，可能把基因組DNA剪切成碎片從而混雜在質(zhì)粒中。如果加入溶液P2后過(guò)于粘稠，無(wú)法溫和混勻，請減少菌體用量。細菌培養時(shí)間過(guò)長(cháng)會(huì )導致細胞和DNA的降解，不要超過(guò)16 小時(shí)。

　　△ P3溶液加入時(shí)間過(guò)長(cháng)

　　P3溶液加入后，放置時(shí)間不要太長(cháng)，否則有可能會(huì )產(chǎn)生小片段DNA污染。

　　△ 含大量核酸酶的宿主菌

　　宿主菌含大量核酸酶，在質(zhì)粒提取過(guò)程中降解質(zhì)粒DNA，影響提取質(zhì)粒DNA的完整性，最好選用不含核酸酶的大腸桿菌宿主菌，如DH5α和Top10。

　　△ 裂解時(shí)間過(guò)長(cháng)

　　加入溶液P2后裂解時(shí)間不應超過(guò)5分鐘。

　　△ 質(zhì)粒的二聚體和多聚體形式

　　質(zhì)粒復制過(guò)程中形成的，與宿主菌相關(guān)，電泳可檢測出。