藥敏實(shí)驗方法

　　1.實(shí)驗材料：

　　1.1培養基：如做大腸桿菌的藥敏試驗可選擇普通營(yíng)養瓊脂或麥康凱培養基，做沙門(mén)氏菌可選擇SS培養基，巴氏桿菌可選擇血液瓊脂。

　　1.2藥敏試紙：購買(mǎi)、自制或廠(chǎng)家提供

　　1.3細菌：從病雞病變部位提取，如肝臟、心臟、脾臟等臟器。

　　1.4接種環(huán)、酒精燈、打孔器、牛津杯

　　1.5移液器、滴頭

　　2.實(shí)驗準備：

　　2.1藥敏片的準備：自制

　　2.1.1藥敏片的制備：取定性濾紙，用打孔機打成6毫米直徑的圓形小紙片，取圓紙片50片放入清潔干燥的青霉素空瓶中，瓶口以單層牛皮紙包扎，經(jīng)15磅15-20分鐘高壓消毒后，放在37℃溫箱或烘箱中數天，使完全干燥。

　　2.2.2抗菌藥紙片制作：在上述含有50片紙片的青霉素瓶?jì)燃尤胨幰哼m量，并翻動(dòng)紙片，使各紙片充分浸透藥液，翻動(dòng)紙片時(shí)不能將紙片搗爛。同時(shí)在瓶口上記錄藥物名稱(chēng)，放37℃溫箱內過(guò)夜，干燥后即密封，切勿受潮，置陰暗干燥處存放，有效期3-6個(gè)月。

　　2.2藥液的制備(用于商品藥的試驗)：按商品藥治療量3-5倍比例配制藥液;如治療量為1L水加1g藥，配制藥液時(shí)就是1g加200-300ml水或1L水加3-5g藥，及配制藥敏片所用的藥液。

　　3.實(shí)驗操作方法：

　　3.1藥敏片法

　　3.1.1在“超凈臺”(或自制無(wú)菌操作臺)中，用(酒精燈)經(jīng)火焰滅菌的接種環(huán)從病料中挑取適量細菌培養物，以劃線(xiàn)方式將細菌涂布到平皿培養基上。具體方式：用滅菌接種環(huán)取適量細菌分別在平皿邊緣相對四點(diǎn)涂菌，以每點(diǎn)開(kāi)始劃線(xiàn)涂菌至平皿的1/2，然后找到第二點(diǎn)劃線(xiàn)至平皿的1/2，依次劃線(xiàn)，直至細菌均勻密布于平皿。(另：可將待試細菌于少量生理鹽水中制成細菌混懸液，將少量混懸液倒入平皿培養基上，輕晃平皿使鋪勻，放置5-10min)。

　　3.1.2將鑷子于酒精燈火焰滅菌后略停，取藥敏片貼到平皿培養基表面。為了使藥敏片與培養基緊密相貼，可用鑷子輕按幾下藥敏片。為了使能準確的觀(guān)察結果，要求藥敏片能有規律的分布于平皿培養基上，一般可在平皿中央貼一片，外周可等距離貼若干片(外周一般可貼4-5片)，每種藥敏片的名稱(chēng)要記住。

　　3.1.3將平皿培養基倒置放于37℃溫箱中培養24小時(shí)后，觀(guān)察效果。

　　4.結果觀(guān)察：

　　在涂有細菌的瓊脂平板上，抗菌藥物在瓊脂內向四周擴散，其濃度呈梯度遞減，因此在紙片周?chē)�一定距離內的細菌生長(cháng)受到抑制。過(guò)夜培養后形成一個(gè)抑菌圈，抑菌圈越大，說(shuō)明該菌對此藥敏感性越大，反之越小，若無(wú)抑菌圈，則說(shuō)明該菌對此藥具有耐藥性。其直徑大小與藥物濃度、劃線(xiàn)細菌濃度有直接關(guān)系。

　　5.判定標準：

　　5.1藥敏實(shí)驗的結果，應按抑菌圈直徑大小作為判定敏感度高低的標準。

　　表1 藥物敏感實(shí)驗判定標準

　　抑菌圈直徑(毫米)　敏感度

　　20以上極敏

　　15-20高敏

　　10-14中敏

　　10以下低敏

　　0 不敏

　　5.2 藥物敏感實(shí)驗判定標準參考表1，抑菌圈直徑在15毫米以上為高敏，10毫米以下為低敏，無(wú)抑菌圈為不敏。

　　6.影響藥敏結果的因素：

　　6.1培養基：應根據試驗菌的營(yíng)養需要進(jìn)行配制。傾注平板時(shí)，厚度合適(約5-6mm)，不可太薄，一般90mm直徑的培養皿，傾注培養基18-20ml為宜。培養基內應盡量避免有抗菌藥物的拮抗物質(zhì)，如鈣、鎂離子能減低氨基糖苷類(lèi)的抗菌活性，胸腺嘧啶核苷和對氨苯甲酸(PABA)能拮抗磺胺藥和TMP的活性。

　　6.2細菌接種量：細菌接種量應恒定，如太多，抑菌圈變小，能產(chǎn)酶的菌株更可破壞藥物的抗菌活性。

　　6.3藥物濃度：藥物的濃度和總量直接影響抑菌試驗的結果，需精確配制。

　　6.4培養時(shí)間：一般培養溫度和時(shí)間為37℃、12-24小時(shí)，有些抗菌藥擴散慢如多粘菌素，可將已放好抗菌藥的平板培養基，先置4℃冰箱內2-4小時(shí)，使抗菌藥預擴散，然后再放37℃溫箱中培養，可以推遲細菌的生長(cháng)，而得到較大的抑菌圈。

　　7.應用

　　藥敏實(shí)驗后，應選擇高敏藥物進(jìn)行治療，也可選用兩種藥物協(xié)助使用，以減少耐藥菌株。選擇高敏藥物時(shí)應考慮藥物的吸收途徑，因為我們藥敏實(shí)驗是藥液直接和細菌接觸，而在給禽用藥的時(shí)候，必須通過(guò)機體的吸收才能使藥物達到一定的效果，所以在給禽用藥時(shí)，高敏藥物一定要配合適宜的給藥方法，這樣才會(huì )達到好的治療效果。

　　附表2 山東省2004年1-5月份大腸桿菌和沙門(mén)氏菌常用藥物敏感程度參考表

　　藥物 大腸桿菌 (細菌)沙門(mén)氏菌(細菌)

　　QD-1(菌株)LC-5JN-7LY-1RZ-5QD-2JN-8LY-1

　　新霉素20(抑菌)18142526231816

　　先鋒必2826302932333126

　　氟苯尼考2221141830282421

　　慶大霉素15001219171212

　　諾氟沙星1012131220201121

　　氧氟沙星1213131123221512

　　先鋒五號1923201828262122

　　蒽諾沙星1214151320161316

　　丁胺卡那17191222323014