熒光蛋白質(zhì)印跡法western blot應注意些什么

　　隨著(zhù)熒光檢測的普及，許多研究人員正考慮將western blot的檢測方法從化學(xué)發(fā)光轉到多重熒光。這一趨勢背后有多個(gè)推動(dòng)力。最重要的是，熒光檢測能夠實(shí)現多重western blot分析，每次能夠同時(shí)檢測幾個(gè)目標蛋白，而不再需要剝離和重新雜交。熒光的其他好處在于動(dòng)態(tài)范圍更寬、信號穩定性更好。

　　熒光blotting的小貼士

　　• 抗體濃度應當優(yōu)化，在幾種不同稀釋度的抗體中孵育膜。選擇信噪比最高的稀釋度。

　　• 從化學(xué)發(fā)光轉到熒光檢測時(shí)，一抗濃度應當增加;通常來(lái)說(shuō)是增加2-5倍。二抗濃度可能也需要優(yōu)化;1:5,000稀釋是個(gè)不錯的起點(diǎn)。在使用特定抗體時(shí)，可以參照生產(chǎn)商的建議。

　　• 為了讓信噪比最高，應使用自發(fā)熒光低的膜，如 Immun-Blot® low fluorescence (LF) PVDF membrane。

　　• 許多封閉液都成功用于熒光檢測。我們建議使用0.5-5% 酪蛋白、最多5%的脫脂奶粉，或最多3% BSA，溶于TTBS中。

　　• 緩沖液中的顆�？赡芡Ａ粼谀ど�，并造成熒光假象。只使用高質(zhì)量的試劑，并對所有緩沖液過(guò)濾滅菌。

　　• 使用鈍的鑷子從邊緣操作。避免劃破膜或弄皺，這會(huì )在熒光檢測時(shí)造成假象。

　　• 使用鉛筆來(lái)標記膜，因為許多墨水都會(huì )發(fā)出熒光。

　　• 溴酚藍會(huì )發(fā)出熒光。確保染料與樣品已分開(kāi)，切掉凝膠上包含染料的部分，或省掉樣品緩沖液中的溴酚藍。

　　• 無(wú)需在暗處開(kāi)展免疫檢測;正常的室內燈光不會(huì )使熒光標記的抗體發(fā)生光漂白。不過(guò)，熒光標記抗體的儲液應保存在暗處。

　　• 在處理膜時(shí)，使用無(wú)粉末的手套，以避免膜上出現假象或指紋。

　　多重分析的小貼士

　　• 使用來(lái)自不同宿主的一抗(如小鼠和兔)。兩個(gè)親緣關(guān)系相近物種的抗體(如大鼠和小鼠)通常會(huì )造成交叉反應，即使抗體已經(jīng)過(guò)交叉吸附。

　　• 使用經(jīng)過(guò)交叉吸附的二抗，以避免交叉反應。

　　• 使用光譜上不同的熒光基團偶聯(lián)物，避免交叉通道熒光。

　　• 在同時(shí)檢測多個(gè)目標之前，單獨優(yōu)化每個(gè)目標的檢測。由于一些一抗并非很特異，在膜上會(huì )產(chǎn)生多條帶，故多重實(shí)驗之前的單目標檢測將有助于確定每個(gè)抗體的條帶模式。

　　• 大部分膜在波長(cháng)較短的激發(fā)光下會(huì )顯示出較高的背景。記住，在藍色通道檢測最強的目標，在綠色通道檢測中等目標，而保留紅色通道來(lái)檢測最弱的目標。