免疫組化染色中“雜音”染色片的種類(lèi)及解決辦法

　　免疫組化除正常的真實(shí)的陽(yáng)性信號外常常會(huì )遇到不正常的背景著(zhù)色，這些非正常的著(zhù)色稱(chēng)為“雜音”染色�！半s音”染色種類(lèi)繁多，產(chǎn)生的原因也多種多樣，為了便于說(shuō)明，筆者將其歸納為下面幾種。

　　1、全片著(zhù)色

　　全片著(zhù)色是指整個(gè)切片全都染上了顏色，著(zhù)色的強度可深可淺，總之，分不清那些組織是陽(yáng)性那些組織是陰性。出現這種現象的原因有：

　　(1)抗體濃度過(guò)高：一抗濃度過(guò)高是常見(jiàn)的原因之一。解決辦法是，每次使用新抗體前應當對其工作濃度進(jìn)行測試，使每一抗體個(gè)體化，找到適合自己實(shí)驗室的理想工作濃度，既使是即用型的抗體也應如此，不能只簡(jiǎn)單的按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色。

　　(2)抗體孵育時(shí)間過(guò)長(cháng)或溫度較高：解決辦法是，嚴格執行操作規程，最好隨身佩帶報時(shí)表或報時(shí)鐘，及時(shí)提醒，避免因遺忘而造成時(shí)間延長(cháng)�，F在流行的二步法(Polymer)敏感性很高，要求一抗孵育的時(shí)間不是傳統的1小時(shí)，而是30分鐘，因此，要根據染色結果進(jìn)行調整。

　　(3)DAB變質(zhì)和顯色時(shí)間太長(cháng)：DAB最好現用現配，如有沉渣應進(jìn)行過(guò)濾后再用。配制好的DAB不應存放時(shí)間太長(cháng)，因為在沒(méi)有酶的情況下，過(guò)氧化氫也會(huì )游離出氧原子與DAB產(chǎn)生反應而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里幾天后再用這種似乎節約的辦法是不可取的。DAB的顯色最好在顯微鏡下監控，達到理想的染色程度時(shí)立即終止反應。不過(guò)當染色片太多時(shí)或用染色機時(shí)，這樣做似乎不現實(shí)，但至少應對一些新的或少用的抗體顯色時(shí)進(jìn)行監控，避免顯色時(shí)間過(guò)長(cháng)。

　　(4)組織變干：修復液溢出后未及時(shí)補充液體、染色切片太多、動(dòng)作太慢、忘記滴液、滴液流失等都是造成組織變干的原因。解決的辦法是操作要認真仔細，采用DAKO筆或PAPPen在組織周?chē)��?huà)圈，可以有效的避免液體流失，也能提高操作速度。

　　(5)切片在緩沖液或修復液中浸泡時(shí)間太長(cháng)(大于24小時(shí))：原因上不清楚，但現象存在。有的實(shí)驗室喜歡前一天將切片脫蠟至修復，第二天加抗體進(jìn)行免疫組化染色，如果將裝有切片和修復液的容器放在4度冰箱過(guò)夜，對結果無(wú)明顯影響，如果放在室溫，特別是炎熱的夏天，會(huì )出現背景著(zhù)色，因此，不可存放時(shí)間太長(cháng)。

　　(6)一抗變質(zhì)、質(zhì)量差的多克隆抗體：注意抗體的有效期，過(guò)期的抗體要麼不顯色要麼背景著(zhù)色。用新買(mǎi)的抗體時(shí)最好設立陽(yáng)性對照和用使用過(guò)的抗體作比較。

　　2、“陰陽(yáng)臉”著(zhù)色

　　指組織一半著(zhù)色一半無(wú)著(zhù)色，形成交界清晰或不甚清晰的兩種染色結果。其成因是試劑僅覆蓋了部分組織而不是全部。如加試劑后未讓試劑流散開(kāi)而集中在部分組織上。通常應該在加完試劑后，仔細看一遍，是否有的組織未被試劑完全覆蓋，如有這種情況，建議用牙簽而不是用吸頭或試劑瓶口將試劑引流開(kāi)使之將組織全部覆蓋。另外，染片盒不平，切片傾斜，雖然開(kāi)始試劑已全部覆蓋了組織，但后來(lái)試劑流向一邊，部分組織未被試劑覆蓋。對于這種問(wèn)題，只要留心或想到了很容易發(fā)現，也很容易解決。有時(shí)，用DAKO(或PAP)筆在組織周?chē)��?huà)圈時(shí)，劃線(xiàn)太靠近或畫(huà)到了組織上，由于筆油的力學(xué)原理，試劑不能達到靠近劃線(xiàn)附近的組織。還有氣泡也可引起陰陽(yáng)分明的著(zhù)色，只是不著(zhù)色區域是圓形，由于氣泡中含氣，試劑被推到周?chē)�，因此，氣泡中心的組織不著(zhù)色。解決辦法是滴加試劑時(shí)手法要輕，有氣泡時(shí)用牙簽捅破。

　　3、切片邊緣著(zhù)色

　　切片邊緣著(zhù)色也是一種常見(jiàn)的現象，這種現象稱(chēng)為邊緣效應。產(chǎn)生的原因：(1)組織邊緣與玻片粘貼不牢，邊緣組織松脫漂浮在液體，每次清洗不易將組織下面試劑洗盡所致。解決辦法：制備優(yōu)質(zhì)的膠片(APES或多聚賴(lài)氨酸)，切出盡量薄的組織切片，不厚于4微米，組織的前期處理應規范，盡量避免選用壞死較多的組織。(2)切片上滴加的試劑未充分覆蓋組織，邊緣的試劑容易首先變干，濃度較中心組織高而致染色深。解決辦法：試劑要充分覆蓋組織，應超出組織邊緣 2 mm。用DAKO筆畫(huà)圈時(shí)，為了避免油劑的影響，畫(huà)圈應距組織邊緣3-4 mm。

　　4、灶片狀著(zhù)色

　　切片中著(zhù)色區東一塊西一塊，呈灶片狀分布，出現這種問(wèn)題的原因有：(1)裱片時(shí)水未排盡，在局部形成氣泡使組織突起，染色時(shí)試劑滲入后不易洗盡，顯色過(guò)深所致。解決辦法是，漂片盒里的氣泡應去盡，晾片熱臺不能平放，應有45度左右的斜度，利于水流走和蒸發(fā)。(2)壞死組織灶，組織壞死后細胞破壞、酶的釋放、蛋白游離、分解，復雜的肽鏈殘段(如Fc段)可能與一抗或/和二抗結合導致最終著(zhù)色。解決辦法是在選擇染色切片時(shí)應避免選擇壞死組織較多的切片。(3)制作APES膠片時(shí)，膠的濃度太高，干燥后在玻片上留下白色小點(diǎn)，顯色時(shí)白色小點(diǎn)著(zhù)色。解決辦法是按照標準的制備方法進(jìn)行，即5%鹽酸酒精(5 ml鹽酸+95%酒精95 ml)浸泡玻片4小時(shí)、熱水沖洗玻片1小時(shí)、蒸餾水洗玻片1分鐘、丙酮浸泡玻片5秒鐘后空氣干燥(室溫)、2% APES(2 ml APES+98 ml丙酮)浸泡玻片5分鐘、玻片過(guò)一下丙酮(1-2秒鐘)、玻片過(guò)一下蒸餾水(1-2秒鐘)、37 度過(guò)夜干燥、室溫儲存備用。如果制片過(guò)程中，因丙酮逐漸揮發(fā)而膠變濃時(shí)可適當加入一些丙酮。

　　5、細胞漿著(zhù)色

　　胞漿著(zhù)色是所有“雜音”染色中最具有欺騙性的著(zhù)色，著(zhù)色區局限在細胞內，間質(zhì)無(wú)著(zhù)色，看上去與真實(shí)的免疫反應著(zhù)色幾乎一樣，很難區別。胞漿里含有較多的蛋白質(zhì)，因此，很多非特異性的染色除了見(jiàn)于間質(zhì)也可以出現在胞漿中。這種原因造成的著(zhù)色，可以通過(guò)血清封閉解決。還有因內源酶造成的著(zhù)色，如血紅蛋白(紅細胞)、肌紅蛋白(肌細胞)、細胞色素(粒細胞、單核細胞)、過(guò)氧化氫酶(肝、腎)，這些可用過(guò)氧化氫進(jìn)行封閉。巨噬細胞吞噬各種抗原物質(zhì)或Fc片斷而出現胞漿著(zhù)色，這種著(zhù)色不易避免，但可以通過(guò)形態(tài)學(xué)辨認出巨噬細胞而引起重視。內源性生物素的著(zhù)色最具有欺騙性，因為它廣泛的存在于組織細胞中，我們研究結果顯示：冰凍組織中存在內源性生物素，經(jīng)福馬林固定石蠟包埋后生物素被封閉，加熱抗原修復后造成內源性生物素暴露，內源性生物素暴露的強度在不同的組織有所不同，從弱陽(yáng)性(+)到強陽(yáng)性(+++)，內源性生物素在組織中的分布形式，既有散在分布也有彌漫分布，主要以顆粒狀形式存在于胞漿中，內源性生物素廣泛存在于上皮源性組織，特別是腺上皮組織，亦存在部分非上皮組織，內源性生物素不僅存在人體組織也存在大鼠組織，內源性生物素暴露的強弱與修復液有關(guān)，其強度增加依次為：檸檬酸、EDTA、EGTA，熱抗原修復暴露的內源性生物素可被雞蛋清封閉，非生物素檢測系統Polymer兩步法(EliVision、EnVision)可避免生物素干擾。

　　7、細胞核著(zhù)色

　　不適當的組織處理可以出現細胞核著(zhù)色，如組織在二甲苯里浸泡時(shí)間太長(cháng)(如從星期五浸泡到下星期一)、緩沖液中浸泡時(shí)間太長(cháng)、組織變干、微波修復液的PH值和修復時(shí)間不當或修復過(guò)程中修復液留下得太少，未沒(méi)過(guò)組織等。解決辦法是嚴格按照操作常規進(jìn)行工作。

　　6、間質(zhì)著(zhù)色

　　著(zhù)色部位主要在間質(zhì)，間質(zhì)著(zhù)色的原因很多，如抗體與組織中的蛋白質(zhì)因蛋白疏水基團相互作用形成非特異性的連接而著(zhù)色，加一抗前的血清封閉這一步就是為了避免非特異型的結合。又如血清中的免疫球蛋白常常滲出到組織間質(zhì)，很容易與抗體結合，造成間質(zhì)著(zhù)色，特別是lambda和kappa染色時(shí)。當甲狀腺膠質(zhì)外溢到組織間質(zhì)時(shí)，做甲狀腺球蛋白染色也會(huì )出現間質(zhì)著(zhù)色�？贵w不純或抗體被污染也可出現間質(zhì)著(zhù)色，我們曾遇到CD20抗體不純，除了染上B細胞外還染上了間質(zhì)。