細胞轉染技術(shù)原理及應用

　　常規轉染技術(shù)可分為兩大類(lèi),一類(lèi)是瞬時(shí)轉染,一類(lèi)是穩定轉染(永久轉染).前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中,因此一個(gè)宿主細胞中可存在多個(gè)拷貝數,產(chǎn)生高水平的表達,但通常只持續幾天,多用于啟動(dòng)子和其它調控元件的分析.一般來(lái)說(shuō),超螺旋質(zhì)粒DNA轉染效率較高,在轉染后24-72小時(shí)內(依賴(lài)于各種不同的構建)分析結果,常常用到一些報告系統如熒光蛋白,β半乳糖苷酶等來(lái)幫助檢測.后者也稱(chēng)穩定轉染,外源DNA既可以整合到宿主染色體中,也可能作為一種游離體(episome)存在.盡管線(xiàn)性DNA比超螺旋DNA轉入量低但整合率高.外源DNA整合到染色體中概率很小,大約1/104轉染細胞能整合,通常需要通過(guò)一些選擇性標記,如來(lái)氨丙基轉移酶(APH;新霉素抗性基因),潮霉素B磷酸轉移酶(HPH),胸苷激酶(TK)等反復篩選,得到穩定轉染的同源細胞系。

　　轉染技術(shù)的選擇對轉染結果影響也很大,許多轉染方法需要優(yōu)化DNA與轉染試劑比例,細胞數量,培養及檢測時(shí)間等.一些傳統的轉染技術(shù),如DEAE右旋糖苷法,磷酸鈣法,電穿孔法,脂質(zhì)體法各有利弊,其主要原理及應用特點(diǎn)如下：

　　磷酸鈣法

　　磷酸鈣DNA復合物吸附細胞膜被細胞內吞 穩定轉染

　　瞬時(shí)性轉染 不適用于原代細胞

　　操作簡(jiǎn)便但重復性差

　　有些細胞不適用

　　DEAE-右旋糖苷法

　　帶正電的DEAE-右旋糖苷與核酸帶負電的磷酸骨架相互作用形成的復合物被細胞內吞 瞬時(shí)性轉染 相對簡(jiǎn)便、結果可重復 但對細胞有一定的毒副作用 轉染時(shí)需除血清

　　電穿孔法

　　高脈沖電壓破壞細胞膜電位,DNA通過(guò)膜上形成的小孔導入 穩定轉染 瞬時(shí)性轉染

　　所有細胞 適用性廣但細胞致死率高,DNA和細胞用量大, 需根據不同細胞類(lèi)型優(yōu)化電穿孔實(shí)驗條件

　　病毒介導法

　　通過(guò)侵染宿主細胞將外源基因整合到染色體中 穩定轉染 可用于難轉染的細胞、原代細胞,體內細胞等

　　逆轉錄病毒

　　特定宿主細胞 但攜帶基因不能太大細胞需處分裂期 需考慮安全因素

　　腺病毒

　　通過(guò)侵染宿主細胞將外源基因整合到染色體中 瞬時(shí)轉染 特定宿主細胞 可用于難轉染的細胞

　　需考慮安全因素

　　陽(yáng)離子脂質(zhì)體法 帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負電的磷酸基團形成復合物被細胞內吞 穩定轉染 瞬時(shí)性轉染

　　所有細胞 適用性廣,轉染效率高,重復性好,但轉染時(shí)需除血清.轉染效果隨細胞類(lèi)型變化大

　　Biolistic顆粒傳遞法

　　將DNA用顯微重金屬顆粒沉淀,再將包被好的顆粒用彈道裝置投射入細胞,DNA在胞內逐步釋放,表達 瞬時(shí)性轉染 可用于：人的表皮細胞,纖維原細胞,淋巴細胞系以及原代細胞

　　顯微注射法

　　用顯微操作將DNA直接注入靶細胞核 穩定轉染 瞬時(shí)性轉染 轉染細胞數有限

　　多用于工程改造或轉基因動(dòng)物的胚胎細胞

　　各種轉染方法的比較：

　　除上述傳統方法外,近年來(lái)國際上推出了一些陽(yáng)離子聚合物基因轉染技術(shù),以其適用宿主范圍廣,操作簡(jiǎn)便,對細胞毒性小,轉染效率高受到研究者們的青睞.其中樹(shù)枝狀聚合物(Dendrimers)和聚乙烯亞胺(Polyethylenimine,PEI)的轉染性能最佳,但樹(shù)枝狀聚合物的結構不易于進(jìn)一步改性,且其合成工藝復雜.聚乙烯亞胺是一種具有較高的陽(yáng)離子電荷密度的有機大分子,每相隔二個(gè)碳個(gè)原子,即每“第三個(gè)原子都是質(zhì)子化的氨基氮原子,使得聚合物網(wǎng)絡(luò )在任何pH下都能充當有效的“質(zhì)子海綿”(proton sponge)體.這種聚陽(yáng)離子能將各種報告基因轉入各種種屬細胞,其效果好于脂質(zhì)聚酰胺,經(jīng)進(jìn)一步的改性后,其轉染性能好于樹(shù)枝狀聚合物,而且它的細胞毒性低.大量實(shí)驗證明,PEI是非常有希望的基因治療載體.目前在設計更復雜的基因載體時(shí),PEI經(jīng)常做為核心組成成分。

　　線(xiàn)型PEI(Line PEI,LPEI)與其衍生物用作基因轉染載體的研究比分枝狀PEI(Branched PEI,BPEI)要早一些,過(guò)去的研究認為在不考慮具體條件,LPEI/DNA轉染復合物的細胞毒性較低,有利于細胞定位,因此與BPEI相比應該轉染效率高一些.但最近研究表明BPEI的分枝度高有利于形成小的轉染復合物,從而提高轉染效率,但同時(shí)細胞毒性也增大.超高分枝的、較柔性的PEI衍生物含有額外的仲胺基和叔胺基,在染實(shí)驗中發(fā)現這種PEI的毒性低,但轉染效率卻較高。

　　GenEscort是采用各種分枝狀和超高分枝狀的小分子PEI與各種含有生理條件下可降解鍵的交聯(lián)劑交聯(lián),合成出的一系列高分枝的可降解的PEI衍生物.聚合物的分枝結構使得其具有較高的正電性,因此易于高效地包裹各種DNA、RNA分子及質(zhì)粒形成小的納米顆粒,從而提高轉染效率,當所形成復合物進(jìn)入細胞以后,其中所含的生理條件下可降解的化學(xué)鍵在細胞內水解,使交聯(lián)聚合物分解為無(wú)細胞毒性的小分子PEI,這樣結構的轉染試劑在體外應用可以獲得高的轉染效率和低的細胞毒性,其可降解性對體內應用也具有重要的意義。