轉錄分析的幾種方法

　　信號通路，只有一個(gè)目的：將細胞的外部信號轉換成細胞的內部變化。不管是胰島素，還是異亮氨酸，抗原還是腎上腺素，它們的終極目的總是如出一則：對轉錄活性的改變。

　　這些對于轉錄活性的影響來(lái)自于轉錄因子與基因的調控區域：如啟動(dòng)子、增強子、沉默子等結合達到的。經(jīng)典的凝膠遷移滯后試驗(the electrophoretic mobility shift assay)已經(jīng)成為證明某種蛋白能與特定的短基因序列結合的有力方法手段。但是凝膠遷移滯后試驗具有速度慢，通量低，不定量和具有放射性的特點(diǎn)。即使完了你還不知道究竟是何種蛋白或者是蛋白的何種基團負責指導體內轉錄的變化。

　　為了弄清楚蛋白與基因序列結合的精確位點(diǎn)，需要利用基于抗體的實(shí)驗。目前已經(jīng)有了一些方便快捷的分析試劑，可以有力的幫助進(jìn)行轉錄研究分析，其中有一些適用于發(fā)現型(篩選多種因子)，有一些用于證實(shí)猜想的。當然這些總是從初期的工作，進(jìn)入精細進(jìn)一步的研究工作。

　　PROTEIN ARRAYS(蛋白芯片)

　　What they are：固定的轉錄因子陣列，利用標記的基因序列或者蛋白質(zhì)進(jìn)行探索。

　　What to use them for：用于發(fā)現和證實(shí)轉錄因子的結合位點(diǎn)或者蛋白-蛋白相互作用。

　　Pros(優(yōu)點(diǎn))：能提供一種在廣泛的因子中檢測與特定序列結合的因子。

　　Cons(缺點(diǎn))：可能會(huì )錯失一些同源因子和一些轉錄后的變化。

　　Things to keep in mind：蛋白分析提供了一種在DNA片段中篩選潛在的結合位點(diǎn)的方法。但這種方法缺乏柔韌性，因此只局限于廣泛的已研究的因子。

　　Available kits：

　　Panomics的 TF Protein Array I for DNA-Protein Interactions (48 proteins, Catalog No. MA3505, $863),

　　Active Motif的 TransArray (38 proteins, two membranes, Catalog No. 31400, $580)。

　　MICROSPHERE ASSAYS(液相芯片)

　　What they are：一些微磁珠的集合在一起，每一個(gè)能與唯一的因子結合位點(diǎn)偶聯(lián)。

　　What to use them for：篩選轉錄因子的表達

　　Pros(優(yōu)點(diǎn))：提供一種廣泛相對無(wú)偏見(jiàn)的第一次篩選手段，理論上，一次能檢測100種不同轉錄因子。

　　Cons(缺點(diǎn))：需要特定的硬件設施(如Luminex reader)，不能完全的解釋哪一種蛋白與哪一種蛋白結合。

　　Things to keep in mind：像RNAse保護試驗一樣，磁珠系統能定量轉錄因子保護寡核苷酸不被消化的能力。來(lái)自匹茲堡大學(xué)醫學(xué)中心Luminex core facility主任Anna Lokshin就表示：“這種微粒方法能得到意想不到的結果，因為它不會(huì )受到假說(shuō)和初步數據的影響”，“通常你會(huì )在自己的知識領(lǐng)域里尋找，但是各自的知識領(lǐng)域是受到限制的�！�

　　Available kits：

　　Invitrogen的 BioSource 3-plex Transcription Factor Assays (100 tests, Catalog No. LHF2041, $845),

　　Marligen Biosciences的 Multiplex Transcription Factor Profiling Kit (20-plex) (96 reactions, Catalog No. 11954-096, Price $2,899).

　　CHROMATIN IMMUNOPRECIPITATION(染色質(zhì)免疫沉淀分析)

　　What they are：來(lái)自天然染色質(zhì)的蛋白質(zhì)-DNA交聯(lián)復合物的免疫沉淀，通過(guò)PCR或者微陣列來(lái)分析。

　　What to use them for：證實(shí)細胞內蛋白質(zhì)-DNA天然結合的細節。

　　Pros(優(yōu)點(diǎn))：是能在體內進(jìn)行的唯一分析方法，能詳細解釋蛋白容量的變化。

　　Cons(缺點(diǎn))：需要一種目的轉錄因子的抗體。同時(shí)ChIP相對于凝膠遷移滯后試驗來(lái)說(shuō)，更為復雜和困難。

　　Things to keep in mind：ChIP不能說(shuō)明白一種特定結合是否是功能性的。因此，我們需要利用轉錄活化分析方法。ChIP很有用，但是需要與其他技術(shù)合用來(lái)解決整個(gè)難題。

　　Available kits：

　　Active Motif的 ChIP-IT (25 reactions, Catalog No. 53001, $395),

　　Upstate的 EZ ChIP (22 reactions, Catalog No. 17-371, Price $329)。

　　OLIGONUCLEOTIDE ARRAYS(寡核苷酸芯片)

　　What they are：固定的寡核苷酸結合位點(diǎn)陣列，一般用于探測核提取物和研發(fā)某種蛋白的抗體。

　　What to use them for：篩選轉錄因子的表達物。

　　Pros(優(yōu)點(diǎn))：提供一種相對廣泛，無(wú)偏見(jiàn)的第一次篩選手段。

　　Cons(缺點(diǎn))：定性分析，需要進(jìn)行研究的轉錄因子對象的抗體。

　　Things to keep in mind：不同的實(shí)驗中存在著(zhù)差異

　　Available kits：

　　Panomics的 Protein/DNA Combo Array (345 sites, Catalog No. MA1215, $1,415),

　　ArrayIt Transcription Factor Microarrays (expected Fall 2006, estimated price $600-$900)。

　　ELISA-BASED ASSAYS(ELISA分析)

　　What they are：基于酶聯(lián)免疫反應的轉錄因子結合分析。

　　What to use them for：定量轉錄因子的濃度。

　　Pros(優(yōu)點(diǎn))：具有快速，定量和高通量的特點(diǎn)。

　　Cons(缺點(diǎn))：需要目的轉錄因子的一種抗體才能進(jìn)行試驗。

　　Things to keep in mind：ELISA-based assays可以比傳統的凝膠遷移分析容納更多的蛋白，并且能將信號放大。具有半定量的特點(diǎn)。

　　Available kits：

　　Clontech的 TransFactor STAT3 Colorimetric Kit (1 x 96 assays, Catalog No. 631953, $583),

　　Panomics的 HIF ELISA Kit (1 x 96 assays, Catalog No. EK1020, $518),

　　Active Motif的 TransAM CREB Kit (1 x 96 assays, Catalog No. 42096, $585)。