電生理基本技術(shù)

　　一.電刺激。

　　二.生物放大器：正確選擇，植物性神經(jīng)沖動(dòng)幅度多為50-100μV。不同組織，應采用不同的參 數。如

　　ECG：振幅0.1-2mV, 靈敏度0.5-1mV，時(shí)間常數0.1-1.0s，高頻濾波1KHz植物性神經(jīng)沖動(dòng)：振幅50-150μV, 靈敏度25-100μV，時(shí)間常數0.01-0.1s，高頻濾波3-5KHz

　　中樞神經(jīng)元單位放電：振幅100-300μV,靈敏度50-100μV，時(shí)間常數0.01-0.1s，高頻濾波5-10KHz

　　三.玻璃微電極：

　　常用尖端0.5-5μm，向細胞內插入時(shí)，需小于0.5μm(細胞直徑的1/10~1/100)，且尖端的傾斜度應相當緩和，一般微電極可分為金屬微電極和玻璃微電極兩類(lèi)。

　　金屬微電極，現多用鍍鉑鎢絲電極(platinum-plated tungsten electrode)，在鎢絲上鍍鉑，可極大改善電極的電學(xué)特性，噪聲可大大降低，加之機械強度大，適合長(cháng)期體外記錄(paréD， Gaudreau H. Projection cells and interneurons of thelateral and basolateral amygdala: distinct firing patterns and differential relation to the thera and delta rhythms in conscious cats. J Neursci, 1996,16(10):3334-3350

　　現要也常用鍍銀碳纖維電極。玻璃微電極記錄易受機械位移的影響，加之尖端的電解質(zhì)會(huì )漏出或堵塞，不適合半小時(shí)以上的長(cháng)時(shí)間記錄，玻璃微電極可分單管和多管微電極。

　　毛坯管在國外多用Pyrex管，國內多用GG-17和95料玻管。細胞外記錄多采用外徑1.5-2mm玻璃，細胞內記錄則采用外徑1mm細玻管，內外徑之比約為2：3或5：6，長(cháng)6-8cm。拉制前必須經(jīng)過(guò)清潔處理。

　　清潔液：用等量的(250ml)王水(可反復應用)。一般毛坯管捆成把放入清潔液中1-2h，取出自來(lái)水沖洗20-30min，再放入無(wú)水酒精中洗滌，再放入盛滿(mǎn)蒸餾水燒杯中加熱煮沸10min，倒去蒸餾水，再換新蒸餾水反復3次，再放入烤箱中烤干，備用，切不可用市售的洗滌劑，以防降低電極充灌液的表面張力而影響沖灌。

　　充灌液常用3mol/L KCl，為避免Cl-擴散，也可用2mol/L醋酸鉀或檸檬酸鉀充灌，也有人用0.5-1mol/L

　　NaCl(低濃度)充灌可降低噪音。細胞外記錄時(shí)，最后再用3-4mol/L NaCl +2%旁胺天藍溶液定位。在膜片鉗中還常加鈣螯合劑，如EGTA。阻抗與不同組織相關(guān)。

　　四.電生理實(shí)驗中噪聲和干擾的形成和排除。

　　(一)來(lái)源。

　　1.干擾信號與生物電生理信號的鑒別。準確區分生物電信號與干擾的偽跡是電生理實(shí)驗的先決條件。

　　2.來(lái)源。主要有三個(gè)方面：

　　其一。物理性干擾。1)靜電和電磁的干擾：實(shí)驗室附近高壓電，室內日光燈可產(chǎn)生50Hz的靜電干擾，尤其是交流電，尤其是50Hz頻率干擾最大(電子設備為50Hz)。其特點(diǎn)是幅度大，波形規則。2)噪聲干擾：電子元件本身產(chǎn)生雜亂無(wú)章電壓和電流稱(chēng)噪聲，一般與放大器內部元件的質(zhì)量與性能有關(guān)。

　　其二。接地不良。1)地線(xiàn)電阻應小。2)儀器故障。產(chǎn)生漏電電流，在地線(xiàn)上形成電位差，產(chǎn)生干擾。3)地線(xiàn)行走過(guò)程中打圈，形成線(xiàn)圈，易接受電場(chǎng)和磁場(chǎng)的干擾。4)各儀器設備應采用一點(diǎn)接地的方式，若采用多點(diǎn)接地，形成大地回路，也會(huì )引起干擾。5)地線(xiàn)過(guò)長(cháng)與電源線(xiàn)形成交流環(huán)路。6)誤用市電三孔中性線(xiàn)作為大地線(xiàn)(中性線(xiàn)上有4-5A電流)。

　　其三。生理性干擾。1)大腦電活動(dòng)時(shí)，眨眼、眼球運動(dòng)均對腦電具有干擾作用。2)實(shí)驗中環(huán)境溫度過(guò)低，動(dòng)物寒戰、抖動(dòng)，引起肌電的發(fā)放而干擾記錄，或因呼吸運動(dòng)引起記錄部位機械位移引起干擾信號。3)心電干擾，頻率與心電一致。

　　(二)排除。

　　1.物理性干擾。1)屏蔽法：用于低頻電和靜電干擾，屏蔽線(xiàn)分布電容較大，線(xiàn)與線(xiàn)之間不可平行排列，更不可為了美觀(guān)而將多線(xiàn)扎在一起，這會(huì )加大分布電容，易偶合高頻干擾噪聲。2)遠離法。3)改變位置法。依電流方向相反，產(chǎn)生反向磁場(chǎng)的原理，改變各個(gè)儀器的位置或放大器輸入的方位，會(huì )使干擾磁場(chǎng)抵消，微電極放大器探頭阻抗高，易引入干擾，實(shí)驗前可反復調整其方向和位置。4)微電極記錄時(shí)盡量減少微電極本身的阻抗，減少輸入阻抗及干擾信號在這個(gè)阻抗上形成干擾電壓降，微電極到探頭的連線(xiàn)<5cm。5)用監聽(tīng)噪聲，以便及時(shí)排除。

　　2.儀器質(zhì)量，盡量改進(jìn)。

　　3.接地不良。地線(xiàn)應盡量短粗，不能與電源線(xiàn)平行或打圈，不 要接在電源線(xiàn)的中性線(xiàn)

　　上，地線(xiàn)單獨埋設，埋置處應較潮濕，附近無(wú)大型變壓電動(dòng)機，并在坑內加些食鹽。

　　4.檢查各儀器 是否漏電。

　　5.慢生物電變化時(shí)用乏極化電極，實(shí)驗對象宜安靜，勿受振動(dòng)。

　　(三)刺激偽跡過(guò)大及防止。1)盡量減少刺激脈沖的波寬和強度。2)在動(dòng)物體或標本上，盡量延長(cháng)刺激部位的距離，在刺激電極和引導電極之間加一接地電極，此電極離引導電極愈近，刺激偽跡就越小;采用變換刺激極性，結合疊加處理，可抵消偽跡。

　　注：微電極中高濃度充灌液易蒸發(fā)，造成電極回路的開(kāi)路，因此常在微電極插入Ag-AgCl絲或鉑金絲后，在微電極尾部開(kāi)口處涂上一層凡士林，防止水分蒸發(fā)。

　　動(dòng)物麻醉和制動(dòng)下，體溫會(huì )下降，故應保溫調節，加溫維持肛溫36-38℃.

　　記錄脊髓背角或腹角神經(jīng)元將脊柱前后拉直以減小呼吸運動(dòng)造成的位移。記錄腦神經(jīng)元應在表面用溫熱石蠟制成一油槽，防止血管博動(dòng)和呼吸運動(dòng)的影響。

　　五.細胞內微電極記錄

　　多用幼年離體標本，其原因：1)幼年動(dòng)物骨骼骨化不完全，結締組織少，神經(jīng)組織易于分離，標本耐缺氧能力強，有的標本可存活數小時(shí)至數天，但標本也可能發(fā)育不完全，如背根和腦干到脊髓的投射纖維要到三周動(dòng)物才完全。神經(jīng)纖維髓鞘化不全，其藥理作用與成年動(dòng)物也不同。從實(shí)驗角度上講，脊髓背腹根短，不利于電生理刺激記錄。小鼠一般應小于15g，制備標本才

　　有可能成功，而這樣小鼠背腹根神經(jīng)節不利于電生理實(shí)驗。最適合的動(dòng)物是金黃地鼠(hamster)，介于大小鼠之間，制備標本活性很好，可能與其冬眠習性有關(guān)，而且其脊髓背腹根長(cháng)達20-25mm，利于電生理記錄。動(dòng)物選擇仍依實(shí)驗而定，同一標本，不同中樞結構對缺氧耐受力也不同。金黃地鼠，若觀(guān)察脊髓背角神經(jīng)元活動(dòng)，可用150-160g體重的鼠均可，但要研究腹角神經(jīng)元，則體重不宜超過(guò)30g。離體標本的灌流注，如ACSF。其中緩沖液成分有兩種，一是重碳酸鹽(bicarbonate)：溫度低(4℃)，配方有利于降低組織興奮性。二是磷酸鹽緩沖液和HEPES緩沖液：其優(yōu)點(diǎn)是接近于人體環(huán)境。各種緩沖液一般都先配母液，臨用前一天，或臨用前稀釋。