高靈敏度分子發(fā)光光譜分析技術(shù)應用心得
[2011/6/1]
一.概述
化學(xué)發(fā)光 (ChemiLuminescence ，簡(jiǎn)稱(chēng)為 CL) 分析法是分子發(fā)光光譜分析法中的一類(lèi)，它主要是依據化學(xué)檢測體系中待測物濃度與體系的化學(xué)發(fā)光強度在一定條件下呈線(xiàn)性定量關(guān)系的原理，利用儀器對體系化學(xué)發(fā)光強度的檢測，而確定待測物含量的一種痕量分析方法�；瘜W(xué)發(fā)光與其它發(fā)光分析的本質(zhì)區別是體系產(chǎn)生發(fā)光 ( 光輻射 ) 所吸收的能量來(lái)源不同。體系產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，必須具有一個(gè)產(chǎn)生可檢信號的光輻射反應和一個(gè)可一次提供導致發(fā)光現象足夠能量的單獨反應步驟的化學(xué)反應。
化學(xué)發(fā)光Western 雜交檢測，是同位素檢測的一種高度靈敏的替代方法。酶標記抗體取代了放射性標記抗體，當它作用于底物時(shí)，可產(chǎn)生光信號。多數特異抗原檢測方法以辣根過(guò)氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶(AP)二級抗體耦聯(lián)物為基礎。信號可通過(guò)感光膠片或專(zhuān)用的成像設備來(lái)采集�；瘜W(xué)發(fā)光底物用于免疫印跡技術(shù)已有十幾年的歷史，目前大部分實(shí)驗室做轉印時(shí)都會(huì )采用化學(xué)發(fā)光技術(shù)進(jìn)行檢測。隨著(zhù)冷CCD化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)的發(fā)展，現在越來(lái)越多的實(shí)驗室都開(kāi)始采用冷CCD的凝膠成像系統進(jìn)行化學(xué)發(fā)光的檢測，膠片成像雖然比自然發(fā)光法靈敏度更高，但也有很多缺點(diǎn)：耗時(shí)，需要暗房，顯影劑和膠片，膠片較貴且為需持續購買(mǎi)的消耗品。同時(shí)由于膠片的線(xiàn)性范圍較窄，因此用膠片上的條帶(特別是表達量較低的條帶)進(jìn)行定量幾乎不可能。冷CCD技術(shù)與X膠片相比具有瞬時(shí)影像處理、高靈敏度和高分辨率、動(dòng)力范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，因此能對條帶進(jìn)行精確定量。當然這項技術(shù)要求底物能產(chǎn)生高強度長(cháng)持續時(shí)間的信號，以保證信號能被冷CCD的凝膠成像系統捕獲。在這方面多家公司都提供了相應的化學(xué)發(fā)光底物或試劑盒，特別是Bio-Rad公司提供的Western-C化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，底物可產(chǎn)生高強度的持續光信號24小時(shí)，因此用戶(hù)可以進(jìn)行多次曝光，最低可檢測至10-19mol，配合Bio-Rad屢獲大獎的化學(xué)發(fā)光成像系統ChemiDoc XRS或VersaDoc系統能得到得到高質(zhì)量的印記信號。
我們實(shí)驗室從05年開(kāi)始采用Bio-Rad的ChemiDocXRS進(jìn)行化學(xué)發(fā)光的檢測，目前已經(jīng)形成一套較為成熟的技術(shù)路線(xiàn)，取得大批的實(shí)驗數據。本文將就Western Blotting的關(guān)鍵步驟及使用ChemiDocXRS的一些心得體會(huì )與大家一起分享。
二.轉印過(guò)程
轉印蛋白的方法有多種，最常用的是電泳轉印方法，該技術(shù)具有快速、有效、并保持蛋白在凝膠中高分辨率的特性。電泳轉印技術(shù)是指在凝膠中分離的蛋白質(zhì)向印跡膜載體轉印的過(guò)程。由于該技術(shù)可以準確、快速、高效的將蛋白轉印到膜上，并可以保持蛋白在凝膠中高的分辨率，而被廣泛的應用于轉移印跡技術(shù)中。
常用的電泳轉印系統有槽轉印系統和半干轉印系統，前者是將凝膠和印跡膜浸入轉印緩沖液槽，然后加電壓進(jìn)行轉印;后者是將凝膠和印跡膜放置于濾紙間形成三明治結構，而后在電極平板間進(jìn)行轉印。
電泳轉印過(guò)程中，凝膠和印跡膜平行放置于兩極間，見(jiàn)圖。根據歐姆定律(Ohm’s)：
V=I*R，R為兩極間物質(zhì)的電阻值，(即轉印緩沖液、凝膠、印跡膜、濾紙的電阻值)，當電極兩端加有電壓時(shí)，就會(huì )在上述物質(zhì)間產(chǎn)生電流，蛋白樣品便發(fā)生轉印。
由于兩極間的電場(chǎng)強度(V/cm)是蛋白轉移的驅動(dòng)力，因此兩極間的電壓和距離稱(chēng)為凝膠上蛋白轉印的關(guān)鍵參數。同樣其他參數包括蛋白的大小、形狀、所帶電荷多少，電轉印緩沖液的pH值、黏度、離子強度、以及凝膠密度也影響著(zhù)蛋白的電轉印效率。
在轉印過(guò)程中將產(chǎn)生大量熱量，因此對電場(chǎng)強度要有一定的限制。轉印中產(chǎn)生的焦耳熱(Joule)與電源參數P成正比，P=I*V=I2R。電泳轉印緩沖液的溫度隨著(zhù)焦耳熱的增加而升高，此時(shí)其電阻卻明顯下降。電阻的降低將會(huì )使轉印過(guò)程和電場(chǎng)強度發(fā)生變化，從而影響電轉印緩沖液的緩沖能力。同時(shí)，系統過(guò)熱還會(huì )引起凝膠的損壞或與印跡膜發(fā)生粘連。從而槽體的散熱能力將直接影響電泳轉印效率。
本室主要以濕轉進(jìn)行轉印，因此本文就濕轉為例，對化學(xué)發(fā)光和ChemiDoc XRS的應用進(jìn)行敘述。
一、轉膜(濕轉)：
(1)轉一張膜需準備2張6.5*10cm的濾紙和1張5.5*8.5cm的PVDF膜。切濾紙和膜時(shí)一定要戴手套，因為手上的蛋白會(huì )污染膜。將切好的PVDF膜浸于甲醇中不少于15分鐘才可使用。
(2)在加有轉移液的搪瓷盤(pán)里放入轉膜用的夾子、兩塊海綿墊、兩張濾紙和浸過(guò)的PVDF膜。
(3)打開(kāi)夾子將黑的一面放入轉膜液中，從下往上依次放入海綿、濾紙、分離膠、PVDF膜、濾紙、海綿。
注意:1整個(gè)過(guò)程在轉膜液中進(jìn)行在鋪每一層時(shí)要用刮子趕氣泡，尤其是膠與膜之間一定不能留有氣泡。
2撬玻璃板剝膠時(shí)動(dòng)作要輕，用刮子將濃縮膠輕輕刮去小心剝下分離膠蓋于濾紙上，用手調整使其與濾紙對齊
(4)將夾子合好，放到轉移槽槽中，要使夾的黑面對槽的黑面，夾的白面對槽的紅面。接通電電轉移時(shí)會(huì )產(chǎn)熱，在槽的一邊有較大空隙，放入事先準備好的冰盒來(lái)降溫。將整個(gè)電泳槽放入一個(gè)大的容器中(大的塑料泡沫盒子最好)，在這個(gè)容器中盛滿(mǎn)冰。
(5) 250毫安恒流轉膜2小時(shí)。
(6)2小時(shí)后，將膜取出，用TBST洗膜5分鐘。
(7)用5%脫脂奶粉室溫封閉。
封閉是為了使抗體僅僅只能跟特異的蛋白質(zhì)結合而不是和膜結合。
脫脂奶粉要用TBST配置，要在干凈的容器里進(jìn)行封閉，且足以覆蓋住膜。
二、孵育一抗
一抗用BSA溶解，根據抗體說(shuō)明書(shū)上的要求稀釋抗體(大部分稀釋度為1：1000)，4℃過(guò)夜。 也可根據抗體量和膜上抗原量適當延長(cháng)或縮短時(shí)間。
(有些一抗室溫孵育一小時(shí)也可得到滿(mǎn)意的結果)
三、孵育二抗
室溫孵育1小時(shí)。 一般采用HRP標記的二抗，稀釋比例為1:2000。
二抗的稀釋比例不能太低，否則容易導致非特異性的結合。
注意：孵育二抗之前一定要用 TBST將膜洗三次，每次五分鐘，時(shí)間一定要夠。
洗滌是為了洗去二抗的非特異性結合，洗滌的效果直接影響結果背景的深淺，所以洗滌一定要干凈。
四、曝光
本實(shí)驗室選用威格拉斯 “western 發(fā)光檢測試劑盒”，如采用Bio-Rad公司的Immun-Star WesternC化學(xué)發(fā)光試劑盒(已針對CCD成像做了優(yōu)化)，可獲得更好的效果。
(1)洗膜，2至3次，每次5分鐘
(2)在照膠儀放膜的平板上加少許水，取一張與平板大小合適的保鮮膜鋪在平板上，排氣泡。
作用：
a 保證PVDF膜能在一個(gè)相對干凈的平臺上曝光，避免污染。
b 鋪上保鮮膜后，背景顏色是純黑色且深淺均勻，這樣當半透明的PVDF膜在白測光下照Marker時(shí)，會(huì )更清晰、明顯。
(3)將膜放入照膠儀，調整明暗、大小、焦距，在目的條帶的marker出，用圓珠筆標一個(gè)印記。
(4)選擇EPI WHITE 光，點(diǎn)擊“White Epi IIIumination”點(diǎn)擊 Auto Expose 獲取marker圖片，圖片最大化，選中圖片，選擇file ->export to jpeg，quantity調至最大值100，保存至文件夾。保存為jpeg格式后，轉至其他電腦即使未安裝quantity one 軟件也可用其他圖像軟件編輯圖片。
(5)將發(fā)光液A液和B液按1：1比例混勻、倒在PVDF膜上，發(fā)光液能蓋住膜即可，關(guān)閉WHITE EPI光(注意膜的位置從照Marker開(kāi)始，不要改變)點(diǎn)擊“Chem Hi Sensitivity”，點(diǎn)擊“Live Acquire”選擇合適的曝光時(shí)間，張數，選擇指定文件夾，保存。
選擇比較滿(mǎn)意的圖片，按如上所說(shuō)轉換至jpeg格式。
例如，Caveolin-3、AKT、ERK、GSK等比較好曝的，可以調至10s一張，一般10張之內就可得到好的效果。其他不太容易出條帶的，可以適當延長(cháng)時(shí)間。
對于內參來(lái)說(shuō)，在曝第一張之前，讓發(fā)光液倒在膜上靜置反映20-30秒，有時(shí)會(huì )得到理想的效果。
(6)marker與目的條帶的比對：用 window自帶的“圖片和傳真查看器”軟件打開(kāi)jpeg格式的marker圖片，用手在屏幕上點(diǎn)住剛剛用圓珠筆畫(huà)的印記，手不要松開(kāi)，此時(shí)還用“圖片和傳真查看器”打開(kāi)jpeg格式的目的條帶的圖片，手點(diǎn)的地方就是剛才marker的位置。
結論：采用Bio-Rad的冷CCD化學(xué)發(fā)光成像系統進(jìn)行化學(xué)發(fā)光的檢測，比傳統的暗室曝光方法更為簡(jiǎn)便，也大大縮短了實(shí)驗時(shí)間。但在成像時(shí)需要注意選擇合適的化學(xué)發(fā)光試劑，以適合CCD的成像檢測。且大部分的化學(xué)發(fā)光試劑均對應暗室曝光的方式，因此在進(jìn)行檢測需要進(jìn)行調整，如對發(fā)光液不能進(jìn)行稀釋?zhuān)仨氁褂迷�。同時(shí)如果條帶的表達比較弱的情況下，如使用常用發(fā)光液可能需要更長(cháng)的成像時(shí)間，當然更好的方法是選擇能快速產(chǎn)生強烈信號的化學(xué)發(fā)光試劑，如Bio-Rad公司的Immun-Star WesternC化學(xué)發(fā)光試劑盒。
化學(xué)發(fā)光 (ChemiLuminescence ，簡(jiǎn)稱(chēng)為 CL) 分析法是分子發(fā)光光譜分析法中的一類(lèi)，它主要是依據化學(xué)檢測體系中待測物濃度與體系的化學(xué)發(fā)光強度在一定條件下呈線(xiàn)性定量關(guān)系的原理，利用儀器對體系化學(xué)發(fā)光強度的檢測，而確定待測物含量的一種痕量分析方法�；瘜W(xué)發(fā)光與其它發(fā)光分析的本質(zhì)區別是體系產(chǎn)生發(fā)光 ( 光輻射 ) 所吸收的能量來(lái)源不同。體系產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，必須具有一個(gè)產(chǎn)生可檢信號的光輻射反應和一個(gè)可一次提供導致發(fā)光現象足夠能量的單獨反應步驟的化學(xué)反應。
化學(xué)發(fā)光Western 雜交檢測，是同位素檢測的一種高度靈敏的替代方法。酶標記抗體取代了放射性標記抗體，當它作用于底物時(shí)，可產(chǎn)生光信號。多數特異抗原檢測方法以辣根過(guò)氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶(AP)二級抗體耦聯(lián)物為基礎。信號可通過(guò)感光膠片或專(zhuān)用的成像設備來(lái)采集�；瘜W(xué)發(fā)光底物用于免疫印跡技術(shù)已有十幾年的歷史，目前大部分實(shí)驗室做轉印時(shí)都會(huì )采用化學(xué)發(fā)光技術(shù)進(jìn)行檢測。隨著(zhù)冷CCD化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)的發(fā)展，現在越來(lái)越多的實(shí)驗室都開(kāi)始采用冷CCD的凝膠成像系統進(jìn)行化學(xué)發(fā)光的檢測，膠片成像雖然比自然發(fā)光法靈敏度更高，但也有很多缺點(diǎn)：耗時(shí)，需要暗房，顯影劑和膠片，膠片較貴且為需持續購買(mǎi)的消耗品。同時(shí)由于膠片的線(xiàn)性范圍較窄，因此用膠片上的條帶(特別是表達量較低的條帶)進(jìn)行定量幾乎不可能。冷CCD技術(shù)與X膠片相比具有瞬時(shí)影像處理、高靈敏度和高分辨率、動(dòng)力范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，因此能對條帶進(jìn)行精確定量。當然這項技術(shù)要求底物能產(chǎn)生高強度長(cháng)持續時(shí)間的信號，以保證信號能被冷CCD的凝膠成像系統捕獲。在這方面多家公司都提供了相應的化學(xué)發(fā)光底物或試劑盒，特別是Bio-Rad公司提供的Western-C化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，底物可產(chǎn)生高強度的持續光信號24小時(shí)，因此用戶(hù)可以進(jìn)行多次曝光，最低可檢測至10-19mol，配合Bio-Rad屢獲大獎的化學(xué)發(fā)光成像系統ChemiDoc XRS或VersaDoc系統能得到得到高質(zhì)量的印記信號。
我們實(shí)驗室從05年開(kāi)始采用Bio-Rad的ChemiDocXRS進(jìn)行化學(xué)發(fā)光的檢測，目前已經(jīng)形成一套較為成熟的技術(shù)路線(xiàn)，取得大批的實(shí)驗數據。本文將就Western Blotting的關(guān)鍵步驟及使用ChemiDocXRS的一些心得體會(huì )與大家一起分享。
二.轉印過(guò)程
轉印蛋白的方法有多種，最常用的是電泳轉印方法，該技術(shù)具有快速、有效、并保持蛋白在凝膠中高分辨率的特性。電泳轉印技術(shù)是指在凝膠中分離的蛋白質(zhì)向印跡膜載體轉印的過(guò)程。由于該技術(shù)可以準確、快速、高效的將蛋白轉印到膜上，并可以保持蛋白在凝膠中高的分辨率，而被廣泛的應用于轉移印跡技術(shù)中。
常用的電泳轉印系統有槽轉印系統和半干轉印系統，前者是將凝膠和印跡膜浸入轉印緩沖液槽，然后加電壓進(jìn)行轉印;后者是將凝膠和印跡膜放置于濾紙間形成三明治結構，而后在電極平板間進(jìn)行轉印。
電泳轉印過(guò)程中，凝膠和印跡膜平行放置于兩極間，見(jiàn)圖。根據歐姆定律(Ohm’s)：
V=I*R，R為兩極間物質(zhì)的電阻值，(即轉印緩沖液、凝膠、印跡膜、濾紙的電阻值)，當電極兩端加有電壓時(shí)，就會(huì )在上述物質(zhì)間產(chǎn)生電流，蛋白樣品便發(fā)生轉印。
由于兩極間的電場(chǎng)強度(V/cm)是蛋白轉移的驅動(dòng)力，因此兩極間的電壓和距離稱(chēng)為凝膠上蛋白轉印的關(guān)鍵參數。同樣其他參數包括蛋白的大小、形狀、所帶電荷多少，電轉印緩沖液的pH值、黏度、離子強度、以及凝膠密度也影響著(zhù)蛋白的電轉印效率。
在轉印過(guò)程中將產(chǎn)生大量熱量，因此對電場(chǎng)強度要有一定的限制。轉印中產(chǎn)生的焦耳熱(Joule)與電源參數P成正比，P=I*V=I2R。電泳轉印緩沖液的溫度隨著(zhù)焦耳熱的增加而升高，此時(shí)其電阻卻明顯下降。電阻的降低將會(huì )使轉印過(guò)程和電場(chǎng)強度發(fā)生變化，從而影響電轉印緩沖液的緩沖能力。同時(shí)，系統過(guò)熱還會(huì )引起凝膠的損壞或與印跡膜發(fā)生粘連。從而槽體的散熱能力將直接影響電泳轉印效率。
本室主要以濕轉進(jìn)行轉印，因此本文就濕轉為例，對化學(xué)發(fā)光和ChemiDoc XRS的應用進(jìn)行敘述。
一、轉膜(濕轉)：
(1)轉一張膜需準備2張6.5*10cm的濾紙和1張5.5*8.5cm的PVDF膜。切濾紙和膜時(shí)一定要戴手套，因為手上的蛋白會(huì )污染膜。將切好的PVDF膜浸于甲醇中不少于15分鐘才可使用。
(2)在加有轉移液的搪瓷盤(pán)里放入轉膜用的夾子、兩塊海綿墊、兩張濾紙和浸過(guò)的PVDF膜。
(3)打開(kāi)夾子將黑的一面放入轉膜液中，從下往上依次放入海綿、濾紙、分離膠、PVDF膜、濾紙、海綿。
注意:1整個(gè)過(guò)程在轉膜液中進(jìn)行在鋪每一層時(shí)要用刮子趕氣泡，尤其是膠與膜之間一定不能留有氣泡。
2撬玻璃板剝膠時(shí)動(dòng)作要輕，用刮子將濃縮膠輕輕刮去小心剝下分離膠蓋于濾紙上，用手調整使其與濾紙對齊
(4)將夾子合好，放到轉移槽槽中，要使夾的黑面對槽的黑面，夾的白面對槽的紅面。接通電電轉移時(shí)會(huì )產(chǎn)熱，在槽的一邊有較大空隙，放入事先準備好的冰盒來(lái)降溫。將整個(gè)電泳槽放入一個(gè)大的容器中(大的塑料泡沫盒子最好)，在這個(gè)容器中盛滿(mǎn)冰。
(5) 250毫安恒流轉膜2小時(shí)。
(6)2小時(shí)后，將膜取出，用TBST洗膜5分鐘。
(7)用5%脫脂奶粉室溫封閉。
封閉是為了使抗體僅僅只能跟特異的蛋白質(zhì)結合而不是和膜結合。
脫脂奶粉要用TBST配置，要在干凈的容器里進(jìn)行封閉，且足以覆蓋住膜。
二、孵育一抗
一抗用BSA溶解，根據抗體說(shuō)明書(shū)上的要求稀釋抗體(大部分稀釋度為1：1000)，4℃過(guò)夜。 也可根據抗體量和膜上抗原量適當延長(cháng)或縮短時(shí)間。
(有些一抗室溫孵育一小時(shí)也可得到滿(mǎn)意的結果)
三、孵育二抗
室溫孵育1小時(shí)。 一般采用HRP標記的二抗，稀釋比例為1:2000。
二抗的稀釋比例不能太低，否則容易導致非特異性的結合。
注意：孵育二抗之前一定要用 TBST將膜洗三次，每次五分鐘，時(shí)間一定要夠。
洗滌是為了洗去二抗的非特異性結合，洗滌的效果直接影響結果背景的深淺，所以洗滌一定要干凈。
四、曝光
本實(shí)驗室選用威格拉斯 “western 發(fā)光檢測試劑盒”，如采用Bio-Rad公司的Immun-Star WesternC化學(xué)發(fā)光試劑盒(已針對CCD成像做了優(yōu)化)，可獲得更好的效果。
(1)洗膜，2至3次，每次5分鐘
(2)在照膠儀放膜的平板上加少許水，取一張與平板大小合適的保鮮膜鋪在平板上，排氣泡。
作用：
a 保證PVDF膜能在一個(gè)相對干凈的平臺上曝光，避免污染。
b 鋪上保鮮膜后，背景顏色是純黑色且深淺均勻，這樣當半透明的PVDF膜在白測光下照Marker時(shí)，會(huì )更清晰、明顯。
(3)將膜放入照膠儀，調整明暗、大小、焦距，在目的條帶的marker出，用圓珠筆標一個(gè)印記。
(4)選擇EPI WHITE 光，點(diǎn)擊“White Epi IIIumination”點(diǎn)擊 Auto Expose 獲取marker圖片，圖片最大化，選中圖片，選擇file ->export to jpeg，quantity調至最大值100，保存至文件夾。保存為jpeg格式后，轉至其他電腦即使未安裝quantity one 軟件也可用其他圖像軟件編輯圖片。
(5)將發(fā)光液A液和B液按1：1比例混勻、倒在PVDF膜上，發(fā)光液能蓋住膜即可，關(guān)閉WHITE EPI光(注意膜的位置從照Marker開(kāi)始，不要改變)點(diǎn)擊“Chem Hi Sensitivity”，點(diǎn)擊“Live Acquire”選擇合適的曝光時(shí)間，張數，選擇指定文件夾，保存。
選擇比較滿(mǎn)意的圖片，按如上所說(shuō)轉換至jpeg格式。
例如，Caveolin-3、AKT、ERK、GSK等比較好曝的，可以調至10s一張，一般10張之內就可得到好的效果。其他不太容易出條帶的，可以適當延長(cháng)時(shí)間。
對于內參來(lái)說(shuō)，在曝第一張之前，讓發(fā)光液倒在膜上靜置反映20-30秒，有時(shí)會(huì )得到理想的效果。
(6)marker與目的條帶的比對：用 window自帶的“圖片和傳真查看器”軟件打開(kāi)jpeg格式的marker圖片，用手在屏幕上點(diǎn)住剛剛用圓珠筆畫(huà)的印記，手不要松開(kāi)，此時(shí)還用“圖片和傳真查看器”打開(kāi)jpeg格式的目的條帶的圖片，手點(diǎn)的地方就是剛才marker的位置。
結論：采用Bio-Rad的冷CCD化學(xué)發(fā)光成像系統進(jìn)行化學(xué)發(fā)光的檢測，比傳統的暗室曝光方法更為簡(jiǎn)便，也大大縮短了實(shí)驗時(shí)間。但在成像時(shí)需要注意選擇合適的化學(xué)發(fā)光試劑，以適合CCD的成像檢測。且大部分的化學(xué)發(fā)光試劑均對應暗室曝光的方式，因此在進(jìn)行檢測需要進(jìn)行調整，如對發(fā)光液不能進(jìn)行稀釋?zhuān)仨氁褂迷�。同時(shí)如果條帶的表達比較弱的情況下，如使用常用發(fā)光液可能需要更長(cháng)的成像時(shí)間，當然更好的方法是選擇能快速產(chǎn)生強烈信號的化學(xué)發(fā)光試劑，如Bio-Rad公司的Immun-Star WesternC化學(xué)發(fā)光試劑盒。
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