微生物實(shí)驗室的安全操作規程

　　1 實(shí)驗室安全

　　1.1 微生物實(shí)驗室的生物安全性

　　1.2 科室安全文檔

　　(a)生物危害防護：實(shí)際操作規程見(jiàn)(《實(shí)驗室生物安全通用要求》，中華人民共和國國家標準GB19489-2004。2004-01-05發(fā)布，2004-10-01實(shí)施。)

　　(b)實(shí)驗室安全：原則和措施見(jiàn)(《微生物和生物醫學(xué)實(shí)驗室生物安全通用準則》，中華人民共和國衛生行業(yè)標準WS 233-2002。2002-12-03發(fā)布，2003-08-01實(shí)施。)

　　1.3 應用：

　　以上的操作規程應用于微生物科室的所有部門(mén)。工作人員或訪(fǎng)問(wèn)人員必須遵守各項規定。

　　1.4 關(guān)于新規定或現行規定的修改案：

　　任何新規定或現行規定的修改案必須通知負責科室安全的人員及相關(guān)人員，他們將建議科室主任考慮實(shí)施。

　　1.5 生物性危害

　　1.5.1 與各種操作有關(guān)的生物危害水平取決于：

　　a.處理的傳染性物質(zhì)的本身：

　　按照傳染性物質(zhì)對個(gè)人和社區和潛在危險性以及經(jīng)空氣傳播的可能性，其劃分成不同等級。所采用的等級劃分詳見(jiàn)"《實(shí)驗室生物安全通用要求》";原則和措施(見(jiàn)《微生物和生物醫學(xué)實(shí)驗室生物安全通用準則》)。

　　b.使用的設備和設施：

　　處理不同等級的傳染性物質(zhì)的要求在"實(shí)驗室安全"中已規定。這些符合要求的設備都要承擔重要臨床工作，科室負責人必須保證中應污染物水平。

　　c.培訓，特別是員工的安全性培訓和安全性經(jīng)驗積累。所有員工應該接受一定訓練，能安全處理任何實(shí)驗室可能碰到的物質(zhì)，避免將實(shí)驗不能處理或規定之外的傳染性物質(zhì)暴露在實(shí)驗室，即使暴露事故在實(shí)驗室，即使暴露事故發(fā)生也要會(huì )正確處理。

　　1.5.2 傳染性物質(zhì)的分類(lèi)

　　1.5.2.1分類(lèi)系統

　　生物危害防護：[見(jiàn)1.2 (a)]，根據生物因子對個(gè)體和群體的危害程度將其分為4級，危害等級Ⅳ最具危害性。

　　1.5.2.2危險群/生物安全水平：1-4

　　a.危險群/生物安全水平：1——對健康成人無(wú)致病性，對社區無(wú)危害性。通常一般微生物操作就足夠，不需特殊安全設備，工作的附近要有洗手設施。培養基上包含未鑒定物，因此，妥善處理對各級安全水平都至著(zhù)重要。

　　b.危險群/生物安全水平：2——人類(lèi)疾病相關(guān)物質(zhì)，這種物質(zhì)對實(shí)驗室工作人員有中度危險，并具有一定程度社區危險性。醫院微生物室所涉及的絕大多數物質(zhì)屬此安全水平，生物危害警告應張貼，并且限制接近，應用醒目標語(yǔ)，若是能產(chǎn)生空氣傳播或飛濺的I，II類(lèi)物質(zhì)都就使用相就的操作臺。實(shí)驗室就提供類(lèi)似防護衣和手套，眼罩尤其是配戴隱形眼鏡者，也應提供類(lèi)似安全水平的洗手設施，并且臨近工作區也應有高壓滅菌裝置。所有廢物和反復使用設備的去污染應有特定的程序。

　　c.危險群/生物安全水平：3——人類(lèi)疾病相關(guān)物質(zhì)，具有潛在空氣傳播性，能引起嚴重，致命疾病，對實(shí)驗室工作人員高度危險，并具有一定程度社區危險性。所有含有或懷疑含有生物案的標本必須標以"小心污染"標簽，并且同時(shí)標于盛放標本容器和申清單。然而作為預防保護還不足夠。應對所有血液，體液，分離的人體組織等有普通防護意識，它們都應視作傳染源。在此生物安全級，實(shí)驗室應控制對其接近。凡涉及該類(lèi)物質(zhì)都應使用I或II類(lèi)工作臺操作，也可以遵循II級操作注意事項，對所有廢物進(jìn)行去污染處理，包括工作服和重復使用設備。

　　d.危險群/生物安全水平：4——對個(gè)人的危險如生物安全3級，但對社區有高度危險性。這些傳染性物質(zhì)包括：

　　蜱源性腦炎病毒

　　支里半亞-剛果牛血熱病毒

　　Marburg Virus

　　艾波拉病毒

　　Lagsa fever Virus

　　Junin HF Virus

　　Machupo HF Virus

　　Guanaruto HF Virus

　　Herpesvirus simiae (B Virus)

　　1.6 以下預防措施，所有實(shí)驗工作人員必須遵守：

　　1.6.1 工作服

　　a.所有實(shí)驗室成員在工作期間必須始終穿著(zhù)所提供的工作服。離開(kāi)實(shí)驗室時(shí)，工作服須掛在指定地方，不得在實(shí)驗室外冼工作服。

　　b.在處理含有或懷疑含有生物安全3級物質(zhì)的標本時(shí)，必須在工作服外穿隔離衣。

　　c.在生物安全操作臺內處理標本和培養基時(shí)，必須戴手套。

　　1.6.2 洗手池

　　洗手池須供應洗潔劑和紙巾。

　　1.6.3 洗手

　　所有工作人員在離開(kāi)工作區必須洗手，并且要先脫去工作服和手套。

　　1.6.4 食物，飲水，吸煙，化妝品

　　食物和飲料不允許帶入任何處理標本的房間.不允許在處理標本的任何地方吸煙.不允許在處理標本的任何地方使用化妝品。

　　1.6.5 傷口和擦傷

　　手上的傷口和擦傷必須覆蓋保護物。

　　1.6.6 個(gè)人衣物

　　個(gè)人衣物不允許帶入實(shí)驗室，并且必須保存在帶鎖的柜子里。

　　1.6.7 口吸移液管

　　這是禁用的。要求使用機械移液裝置。

　　1.7 常規預防措施應用于所有血液、體液、組織標本的操作中：

　　1> 無(wú)論何時(shí)都應盡可能避免使用注射器，針頭或其它銳器。

　　2> 使用過(guò)的針頭和一次性切割器必須丟入專(zhuān)門(mén)的帶有蓋子和桶內，以備安全處理、防止容器過(guò)滿(mǎn)盛裝。

　　3> 使用過(guò)的針頭不許重新使用或再用手操作。

　　4> 打爛的玻璃必須放入堅硬的容器(不要用手)，然后再放入黑色垃圾袋，如果是污染的，使用黃色垃圾袋。

　　5> 在接觸具有潛在性傳染性標本培養基、組織，必戴保護性手套，防止皮膚直接接觸。如果手套有可見(jiàn)的污染，必須先除去污染，再更換。手上有皮炎或傷口的工作人員的需要間接接觸傳染性物質(zhì)的人員應戴保護性手套。

　　6> 在處理完標本、結束工作，甚至在上述規定帶手套時(shí)，應常規洗手。

　　7> 當血液、血液制品或其它體液污染發(fā)生時(shí)，應停止工作洗手，戴一次性手套再清除污染區。建議用含有效氯1000ppm的次氯酸鈉溶液。如果污染區較大用浸有次氯酸鈉溶液的濕布覆蓋10min去污染，并標示相應的警告，丟棄廢物及手套到生物安全級物理容器。注意飛濺的水滴和流淌會(huì )將污染帶到主污染區以外。

　　8> 所有在實(shí)驗室使用的具有潛在污染性的物質(zhì)都需去污染，最好先高壓，再做處理。

　　9> 任何可能產(chǎn)生飛濺或氣霧的操作都應在生物安全操作臺里進(jìn)行。這些操作包括離心，分離血清，混合，超聲，收集組織受精卵，以及處理含有濃集的感染物質(zhì)標本。

　　1.8 實(shí)驗室物質(zhì)處理

　　a> 黑色塑料袋用來(lái)收集未污染或經(jīng)高壓過(guò)需處理的廢物。

　　b> 廢紙屢用來(lái)收未污染的廢紙，用過(guò)的紙巾等。

　　c> 所有可能傳染的物質(zhì)必須高壓或焚化。

　　d> 所有丟棄的標本，培養基和實(shí)驗室廢物必須放在專(zhuān)門(mén)容器里

　　e> 用白色聚丙烯罐盛裝2%新鮮配置次氯酸液，以供工作中丟棄標本，污染吸頭，棉拭子臨時(shí)處理待一天工作結束之后，再經(jīng)高壓處理。

　　f> 黃色塑料袋用來(lái)處理污染的實(shí)驗室廢物。它們應封口再由工人拿去焚燒。

　　g> 帶蓋，帶標簽硬質(zhì)容器用來(lái)盛裝針頭的銳器。

　　1.9 實(shí)驗室傳染性物的消毒

　　高壓

　　a.所有培養基的傳染性物質(zhì)都要高壓，除非準備焚燒的，高壓的最大好處是使傳染性物質(zhì)離開(kāi)實(shí)驗室可保證安全。

　　b.用作此目的的高壓設備應在醫學(xué)技師監督下由實(shí)驗室工人操作。

　　c.高壓設備應定期由醫院設備組測試，檢修。這些測試包括商業(yè)使有的芽胞試紙實(shí)驗。多個(gè)高壓設備應有使用記錄，并自使用之日起由醫學(xué)技師連續記錄。任何不符都要向安全人員報告。

　　1.10 去污染

　　去污染劑：

　　1> 次氯酸溶液：用白色聚丙烯罐裝新鮮配置的含有效氯1000ppm的2%次氯酸溶液，放在多個(gè)工作室。

　　2> 5%的Printol：其50%水溶液用來(lái)處理濺在地板和家具上的污染。

　　3> 戊二醛：新鮮配制成一定濃度，主要用于不能使用次氯酸鈉的儀器去污染，如離心機等。

　　4> 75%乙醇：主要用于對清潔表面的快速去污染。

　　1.11 離心機

　　1.11.1 注意事項：

　　a> 使離心機用的試管應具是厚管或塑料的，離心前應仔細檢查是否缺損。

　　b> 離心機需放置在合適的位置，操作都應能看見(jiàn)離心缸，以便能正確地將離心架放在轉子上。

　　c> 離心桶和離心架配對使用，負載后需仔細平衡。

　　d> 為避免脫架和試管內溶液濺出，開(kāi)始采用低轉速，然后逐漸升高。

　　e> 離心機內缸應由高級人員定期檢索，內壁必須用戊二醛定期清潔，去污染。

　　f> 在對含有或懷疑含有生物安全操作3級標本離心時(shí)，必須加蓋密封，密封蓋只有在一級生物安全操作臺內才能打開(kāi)。

　　1.11.2 離心時(shí)，試管破裂

　　a> 如果正在離心時(shí)，發(fā)生或懷疑發(fā)生試管破裂，電動(dòng)機應立即斷電，并在30min后才能打開(kāi)離心機蓋。

　　b> 如離心后發(fā)現破裂，應立刻關(guān)閉機蓋，保持至少30min。

　　c> 立即通知安全員。

　　d> 戴厚手套，使用鑷子或用鑷子夾棉鑒清除破碎玻璃碎片。

　　e> 所有破裂試管，玻璃碎片，離心桶和轉子必須放在專(zhuān)門(mén)消毒劑中去污染，要求消毒劑不具腐蝕性，對浸生物安全物質(zhì)有效。然后，或者浸泡至24小時(shí)，或者高壓。

　　f> 未破裂，帶蓋的試管也應放在另一含有消毒劑的容器中1后，再對其內容物處理。

　　i> 離心缸必須用戊二醛棉拭子清潔，過(guò)夜，再重復擦拭，再用水清潔洗凈并干燥。

　　g> 含有生物安全3級物質(zhì)的密封離心桶必須在密封狀態(tài)下取出，在一級生物安全操作臺內打開(kāi)。如果試管破裂，離心桶密封蓋應松松地蓋上，對離心桶高壓。

　　1.12 破裂和溢出

　　任何重要的破裂的溢出都應通知安全人員。在處理含有或懷疑含有生物案例的溢出物，應先得到安全人員的建議。

　　1.12.1 病毒培養基的泄漏

　　a> 用浸有20%次氯酸鈉的紙巾覆蓋濺灑出的污染物用容器碎片。

　　b> 覆蓋10-15min。

　　c> 戴一次性手套，清掃紙巾和碎片于合適的容器(如塑料袋，但不包括含有碎玻璃或其它銳利物體)，用一片硬紙板去清掃，不能用刷子或塵撣，除非它們適于高壓。手指遠離碎玻璃。

　　d> 將碎片和使用后的廢物放在實(shí)驗室廢物箱。

　　e> 用常規工作消毒劑擦拭污染區及其周?chē)�可能飛濺區。

　　1.13 泄漏的標本

　　實(shí)驗室不泄漏的標本，但要以塑料密封后退還到病房。

　　1.14 紫外線(xiàn)消毒：培養基，試劑分裝和病人血清應存放-70°C和-30°C冰箱。操作存放于-30°C或以下溫度冰箱物質(zhì)，應戴手套，例如當標本從低溫冰箱取出或放入時(shí)。

　　1.15 生物安全柜(臺)

　　實(shí)驗室應配備II級生物安全柜。

　　1.15.1 級別

　　I ：基本要求：定向流動(dòng)保護，要求氣流從外流入安全柜，并且遠離操作者，指向傳染物。經(jīng)HEPA過(guò)濾排后，緊好由導管引向室外，以便清除去污染后的各種蒸汽。

　　II：基本要求：經(jīng)過(guò)濾氣體垂直流向，既保護操作者也要保護工作不受污染。

　　IIA：70%的過(guò)濾氣體重新循環(huán)至工作區，廢氣導向室外經(jīng)HEPA過(guò)濾。和內流經(jīng)式工作區的氣流速度平均0.4m/s或略高。

　　IIB：流進(jìn)氣體流速平均0.5m/s或更好。按照不同型別(IIB1，IIB2，IIB3)，氣體排出比例從70%到100%。根據工作選擇不同型。如有毒化學(xué)物質(zhì)和放射線(xiàn)同位素不能再循環(huán)至工作區。

　　III ：基本要求：操作者與傳染物安全隔離，并且整個(gè)操作過(guò)程都要提高。安全柜所在的環(huán)境也要一定程度隔離，以防手套破裂。

　　1.15.2 生物安全柜的安裝

　　安全柜要發(fā)揮某安全防護功能必須注意安裝位置，廢氣應通過(guò)管道以保護環(huán)境不受污染。如果需購置這類(lèi)設備應聯(lián)系CUHK安全辦公室，在種類(lèi)，牌子，樣式，安裝位置和安裝以及與其它設施的相鄰關(guān)系上獲得指導。

　　1.15.3 常規檢查和安全操作以及工作區的消毒

　　有一份操作規程詳盡地敘安全柜的常規使用也應包括安全柜發(fā)生意外時(shí)應采取的行動(dòng)。每一個(gè)使用者必須閱讀規程使后簽名。

　　1.15.4 注意：

　　安全柜應盡可能避免使其處于不安全狀態(tài)，但有時(shí)因為安全柜的意外，使用者被迫這樣做。此時(shí)，應張貼注意以警告其它人不得再使用。

　　1.15.5 去污染和再認證

　　由受過(guò)訓練的人員,配戴個(gè)人防護用具,來(lái)做污染工作。要求：安全柜在密閉條件下用干燥多聚甲醛蒸汽醺蒸，使用濃度8500ppm。(安全柜的體積應包括外周供應和廢氣過(guò)濾設備。)在溫度20-25°c，相對溫度不低于60%環(huán)境保持4h，甲醛蒸汽，如果允許，可直接抽出室外，若不允許可在安全柜內用氨基重碳鹽吸收。

　　因為空氣有限的穿透力，在處理潛在傳染性物質(zhì)時(shí)最好使用HEPA過(guò)濾器，以及高壓或焚化后再丟棄。

　　1.17.5.2 再認證

　　這項工作由專(zhuān)門(mén)人員進(jìn)行，去污染后安全柜性能再認證定，及過(guò)濾器的更換，測試是否有漏氣，調試空氣流速是否合規定，以及檢測過(guò)濾器的性能。再認證應至少一年做一次，或是裝置移動(dòng)，過(guò)濾器維修后。應備有去污染，維修和再認證的記錄，并且應方便使用者的查閱。

　　2. 實(shí)驗安全操作程序：

　　2.1 工作人員在采集標本過(guò)程中應當防止病原微生物擴散和感染，并對標本的來(lái)源、采集過(guò)程和方法等作詳細記錄。

　　2.3 實(shí)驗過(guò)程中絕對禁止吸煙、飲食等，不要以手撫頭面部等。

　　2.4 處理樣本的過(guò)程中易產(chǎn)生高危害氣溶膠時(shí)，要求同時(shí)使用適當的個(gè)人防護裝備、生物安全柜和/或其它物理防護設備。如可產(chǎn)生含生物因子的氣溶膠，應在適當的生物安全柜中操作。細菌的分離培養、菌種開(kāi)封、轉種、研磨、稀釋等操作，均應在生物安全柜中進(jìn)行。

　　2.5 使用接種環(huán)進(jìn)行操作時(shí)，接種環(huán)應在工作燈的內焰中燃燒，以避免菌液或菌塊飛濺。

　　2.6 稀釋菌液時(shí)，吸管、針管要緩慢插入試管或燒瓶底部，小心操作避免產(chǎn)生氣泡或氣溶膠。

　　2.7 使用注射器加樣時(shí)，用過(guò)的針頭切勿再重新入套或拔開(kāi)注射器與針頭，應直接放入銳器收集器，以免劃破皮膚造成接種感染。

　　2.8 菌株庫要設專(zhuān)人管理，并按照國家微生物菌毒種管理辦法執行。2.9進(jìn)行毒菌操作過(guò)程中，不要穿戴巳經(jīng)污染的防護性手套觸摸門(mén)柄、儀器或毒菌區以外區域，避免由于粗心擴大污染范圍。

　　2.10 試驗結束后，操作過(guò)程中所有可能與生物危險物接觸或被污染的試驗器械和物品，能夠高壓消毒的必須高壓消毒，不能進(jìn)行高壓消毒的設備、儀器，應使用有效的消毒劑擦洗后再以紫外燈近距離長(cháng)時(shí)間消毒。

　　2.11 實(shí)驗中發(fā)生意外污染情況，應立即通知主管人員并做好處理污染物和相應區域的準備，不得擅自采用其它禁止的方法進(jìn)行消毒處理。

　　2.12 實(shí)驗室內任何微生物的樣本，廢棄物都必須經(jīng)高溫高壓滅菌后，方可按一般垃圾處理。

　　2.13 實(shí)驗室所用任何個(gè)人防護裝備應符合國家有關(guān)標準的要求。實(shí)驗室應確保具備足夠的有適當防護水平的清潔防護服供使用。還應穿戴其它的個(gè)人防護裝備，如手套、防護鏡、面具、頭部面部保護罩等。

　　3. 實(shí)驗室污物處理及消毒操作程序：

　　3.1 實(shí)驗室含有生物危險物的臨床標本及被污染的一次性用品，試驗完成后，應在操作臺或實(shí)驗區域內以紫外燈近距離照射消毒 2小時(shí)以上，再經(jīng)高壓消毒后方可丟棄或焚燒。

　　3.2 可重復使用的實(shí)驗用品及器材，完成實(shí)驗后，應在操作臺或實(shí)驗區域內經(jīng)紫外燈近距離照射消毒2小時(shí)以上后，再交有關(guān)人員進(jìn)行高壓消毒和煮沸洗刷。

　　3.3 實(shí)驗用的試管、吸管、注射器，須裝在加蓋不漏的容器內，經(jīng)高壓滅菌后取出。

　　3.4 培養物或實(shí)驗室垃圾，在丟棄前必須經(jīng)高壓消毒和紫外燈近距離長(cháng)時(shí)間照射處理。不允許積存垃圾和實(shí)驗室廢棄物。已裝滿(mǎn)的容器應定期運走。在去污染或最終處置之前，應存放在指定的安全地方，通常在實(shí)驗室區內。

　　3.5 實(shí)驗室廢棄物應置于適當的密封且防漏容器中安全運出實(shí)驗室。有害氣體、氣溶膠、污水、廢液應經(jīng)適當的無(wú)害化處理后排放，應符合國家相關(guān)的要求。

　　3.6 實(shí)驗過(guò)程中，如標本或含標本的前消化處理液被打翻污染了操作臺或地面，應以吸滿(mǎn)70%酒精的衛生紙覆蓋污染區，15分鐘以后衛生紙方可移去。

　　3.7實(shí)驗室內未經(jīng)消毒的污水，禁止直接排入公共排水系統，更不允許混入居民生活垃圾。

　　4. 意外事故處理程序：

　　4.1 如果發(fā)生意外，必須立即通知實(shí)驗室主管人員和醫院生物安全辦公室，并在有關(guān)人員的指導監督下對出事現場(chǎng)進(jìn)行處理，絕對禁止未經(jīng)報告而私自對出事現場(chǎng)給予非規范的處理。

　　4.2 實(shí)驗過(guò)程中，如污染物濺落到身體表面，或有割傷、刺傷、燒傷、燙傷等情況發(fā)生，應立即停止實(shí)驗工作進(jìn)行緊急處理，更換被污染的實(shí)驗服，皮膚表面用消毒液清洗，傷口以碘酒或酒精消毒，眼睛用無(wú)菌生理鹽水沖洗。

　　4.3 如果發(fā)生菌液溢出，含菌種的培養管破碎等，造成中 、小面積污染，可用比污染面積大25%以上的紗布覆蓋污染區域，邊緣用脫脂棉圍住，向紗布傾倒5%苯酚溶液或70%的酒精，浸泡2小時(shí)以上(其間適量加溶液防止干燥)，再經(jīng)紫外燈近距離(1米內)照射2小時(shí)以上;被污染的器械、容器等立即浸泡于70%酒精中2小時(shí)以上，再次著(zhù)防護衣進(jìn)入房間，將污染溢出物和用于清潔的紗布放入可耐受高壓的雙層塑料袋內并盡快高壓。

　　4.4 如果發(fā)生氣溶膠污染或大面積污染，應立即停止實(shí)驗并關(guān)閉實(shí)驗室，對污染區域進(jìn)行紫外燈照射消毒過(guò)夜;第二天對污染區進(jìn)行24小時(shí)封閉空氣熏蒸消毒(乙醛消毒法﹕5ml乙醛+2g高錳酸鉀/m3空間)。

　　4.5 臨床醫務(wù)人員應對事故受害者和消毒人員進(jìn)行醫學(xué)隨訪(fǎng)。