細胞培養中污染的清除和預防

　　一、污染的清除

　　培養細胞一經(jīng)污染，多數較難處理。如果污染細胞價(jià)值不大，宜棄之;有細胞株留存的或可購置的，可在尋找原因后徹底消毒操作室，復蘇或重新購置細胞，再培養。若污染細胞價(jià)值較大，又難于重新得到，可采取以下辦法清除。

　　(一)使用抗生素

　　抗生素對殺滅細菌較有效。聯(lián)合用藥比單獨用藥效果好。預防用藥比污染后再用藥效果好。預防用藥一般用雙抗生素(青霉素100u/mL加鏈霉素100μg/mL)，污染后清除用藥需采用大于常用量5～10倍的沖洗法，于加藥后作用24～48小時(shí)，再換常規培養液。此法在污染早期可能有效。所用抗生素品種除青霉素、鏈霉素外，還可用慶大霉素、卡那霉素、多粘菌素、四環(huán)素、制霉菌素等。常用400～800μg/mL卡那霉素或200μg/mL四環(huán)素處理，每隔2～3日換液1次，傳1～2代進(jìn)行治療。近年來(lái)有報道，4-氟，2-羥基喹啉(Ciprofloxacin,Cip)、截耳素衍生物(Pleu-romutilinderivative,BM-Cyclin2:BM-1和四環(huán)素衍生物(BM-2)等三種抗生素單用或合用對殺滅支原體有效。這三種抗生素均用PBS配成250X濃縮液，-20℃保存備用，使用濃度Cip為10μg/mL，BM-1為10μg/mL，BM-2為5μg/mL。使用時(shí)先吸除污染的培養液，加入含BM-1的RPMI1640培養液，3天后再吸除培養液，加入含BM-2的RPMI1640培養液，培養4天，如此連續3個(gè)輪次，直至用33258熒光染色鏡檢證明已清除支原體后，再加正常培養液培養傳代3-4次。

　　(二)加溫處理

　　將污染的組織培養物放在41℃培養18小時(shí)，可殺死支原體，但對細胞有不良影響。所以在處理前要進(jìn)行預試驗，摸索能最大限度殺死支原體又對細胞影響最小的加熱時(shí)間。此法有時(shí)不可靠。若先用藥物處理后，再以41℃加溫處理效果更佳。

　　(三)使用支原體特異性血清

　　用5%的兔支原體免疫血清(血凝效價(jià)1:320以上)可去除支原體污染，因特異抗體可抑制支原體生長(cháng)，故經(jīng)抗血清處理后11天即轉為陰性，并且5個(gè)月后仍為陰性。但此法比較麻煩，不如用抗生素方便、經(jīng)濟。

　　(四)其他方法

　　除了上述去除污染的方法外，還有動(dòng)物體內接種除菌法、巨噬細胞吞噬法、污染培養瓶中加溴尿嘧啶再用光照射的方法及過(guò)濾法等，但均較麻煩，且效果不確定。所以一旦支原體污染，除非有特別重要價(jià)值，一般均棄之重新培養。

　　二、污染的預防

　　預防是防止細胞培養過(guò)程中發(fā)生污染的最好辦法。只有預防工作做在前，才能將發(fā)生污染的可能性降到最小程度。一般預防可從以下幾方面著(zhù)手：

　　(一)從物品、用品消毒滅菌著(zhù)手

　　細胞培養所用物品清洗、消毒要徹底，各種溶液滅菌除菌要仔細，并在無(wú)菌試驗陰性后才能使用。操作室及剩余的無(wú)菌器材要定期清潔消毒滅菌。

　　(二)從操作者做起

　　1、操作者責任心要強，要細心穩重，操作技術(shù)要熟練。進(jìn)無(wú)菌室前要用肥皂洗手或用5%新潔爾滅浸泡5分鐘，按規定穿隔離衣。進(jìn)入后關(guān)好門(mén)，坐下來(lái)盡量少走動(dòng)。工作開(kāi)始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和燒灼瓶口。事先要嚴格檢查器材、溶液和培養物，不要把污染品或未經(jīng)消毒的物品帶入無(wú)菌室內，更不能隨便使用，以免造成大批污染。

　　2、操作者動(dòng)作要輕，必須在火焰周?chē)鸁o(wú)菌區內打開(kāi)瓶口，并將瓶口轉動(dòng)燒灼。操作時(shí)盡量不要談話(huà)，若打噴嚏或咳嗽應轉向背面。

　　3、操作時(shí)要常更換吸管，切勿一根吸管做到底。一旦發(fā)現吸管口接觸了手和其他污染物品應棄去。實(shí)驗完畢及時(shí)收拾，保持實(shí)驗室清潔整齊，最后用消毒水浸泡的紗布擦臺面。

　　(三)防止細胞交叉污染

　　在進(jìn)行多種細胞培養操作時(shí)，所用器具要嚴格區分，最好做上標記便于辨別。并按順序進(jìn)行操作，避免一起進(jìn)行時(shí)易發(fā)生混亂。

　　在進(jìn)行換液或傳代操作時(shí)，注射器和滴管不要觸及細胞培養瓶瓶口，以免把細胞帶到培養液中污染其他細胞。

　　所有細胞一旦購置，或從別處引入，或自己建立，均應及早留種凍存，一旦發(fā)生污染可棄之復蘇，重新培養。