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    三分鐘帶你了解當前最熱的基因編輯技術(shù)

    [2017/4/13]

    基因編輯技術(shù)指能夠讓人類(lèi)對目標基因進(jìn)行“編輯”，實(shí)現對特定DNA片段的敲除、加入等。而CRISPR/Cas9技術(shù)自問(wèn)世以來(lái)，就有著(zhù)其它基因編輯技術(shù)無(wú)可比擬的優(yōu)勢，技術(shù)不斷改進(jìn)后，更被認為能夠在活細胞中最有效、最便捷地“編輯”任何基因�；蚓庉嬍且环N遺傳工程技術(shù)，針對某個(gè)序列已知但功能未知的序列，通過(guò)改變生物的遺傳基因，使其特定的基因功能喪失作用，通過(guò)研究對生物體造成的影響，進(jìn)而推測出該基因的生物學(xué)功能。本文為你科普基因編輯三大技術(shù)：
    　　
    　　基因敲除
    　　
    　　進(jìn)行DNA水平編輯。一般用于構建基因敲除鼠模型。
    　　
    　　CRISPR/Cas9：CRISPR/Cas9系統作為細菌和古細菌的獲得性免疫系統，通過(guò)RNA介導特異性的切割外源遺傳物質(zhì)，用以對抗入侵的病毒和質(zhì)粒。使用Cas9切口酶和一對sgRNA，兩個(gè)相近的切口造成DNA雙鏈斷裂，誘導細胞發(fā)生非同源末端連接修復，造成目的基因的突變。
    　　
    　　CRISPR/Cas9技術(shù)自問(wèn)世以來(lái)，取代“鋅指核酸內切酶（ZFN）”、“類(lèi)轉錄激活因子效應物核酸酶（TALEN），成為科研、醫療等領(lǐng)域的有效工具”.一般通過(guò)體外轉錄得到sgRNA與cas9的mRNA，通過(guò)注射到原核期受精卵內，移植到假孕母鼠體內獲得基因編輯的小鼠進(jìn)行基因功能研究。
    　　
    　　構建方法：
    　　
    　　確定待敲除基因的靶位點(diǎn)。
    　　
    　　設計識別靶位點(diǎn)的識別的一對sgRNA。
    　　
    　　構建可表達sgRNA的Cas9質(zhì)粒。
    　　
    　　體外轉錄sgRNA 和Cas9 RNA。
    　　
    　　將sgRNA和Cas9 RNA直接注射入受精卵檢測sgRNA活性。
    　　
    　　將有活性的sgRNA和Cas9 RNA直接注射入受精卵建立Founder。
    　　
    　　將Founder自交得到F1代。
    　　
    　　適用范圍：
    　　
    　　制備敲除鼠，利用敲除鼠進(jìn)行基因功能的研究；進(jìn)行細胞水平敲除基因時(shí)，可以選擇慢病毒載體，構建lenticrispr-v2質(zhì)粒，通過(guò)包裝病毒進(jìn)行細胞水平敲除。
    　　
    　　基因敲減
    　　
    　　RNA水平，是指通過(guò)降解具有同源序列靶基因的mRNA，達到阻止基因表達的作用。一般用于細胞水平敲減基因。
    　　
    　�。�1）RNA干擾：
    　　
    　　是siRNA雙鏈結合一個(gè)核酶復合物從而形成所謂RNA誘導沉默復合物RISC。激活的RISC通過(guò)堿基配對定位到同源mRNA轉錄本上，并在距離siRNA3’端12個(gè)堿基的位置切割mRNA，該mRNA發(fā)生降解而導致基因表達沉默，是一種特異性的轉錄后基因沉默。
    　　
    　　一般合成針對靶基因的siRNA，通過(guò)轉染的方法使之進(jìn)入細胞內，使靶基因沉默。這一方法受轉染效率的影響較大。目前有不少基因的siRNA已經(jīng)有商業(yè)產(chǎn)品，所以使用時(shí)買(mǎi)來(lái)就可以了，比較方便。
    　　
    　　適用范圍：
    　　
    　　一般通過(guò)公司合成后，通過(guò)轉染細胞進(jìn)行細胞水平敲減。
    　　
    　�。�2）shRNA：
    　　
    　　“短發(fā)夾RNA”，shRNA包括兩個(gè)短反向重復序列，中間由一莖環(huán)（loop）序列分隔的，組成發(fā)夾結構，由polⅢ啟動(dòng)子控制。隨后再連上5-6個(gè)T作為RNA聚合酶Ⅲ的轉錄終止子。
    　　
    　　構建shRNA的病毒表達載體，常用的病毒載體有腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、慢病毒載體等，機制與質(zhì)粒載體相似，利用了病毒感染細胞效率比較高的特點(diǎn)，解決了用質(zhì)粒載體轉染效率低的缺陷。
    　　
    　　構建方法：
    　　
    　　shRNA設計：設計RNA干擾序列是RNAi實(shí)驗的關(guān)鍵。
    　　
    　　載體構建：可根據實(shí)驗需求選擇慢病毒、腺病毒載體。
    　　
    　　轉染細胞：常用的方法包括磷酸鈣轉染、脂質(zhì)體轉染、電穿孔轉染等
    　　
    　　觀(guān)測GFP 熒光和穩定表達細胞系篩選：可用于帶有GFP標簽的質(zhì)粒載體。
    　　
    　　檢測RNA 干擾效率：可以在蛋白水平或mRNA水平檢測RNA干擾效率。
    　　
    　　適用范圍：
    　　
    　　一般通過(guò)構建慢病毒、腺病毒等進(jìn)行細胞水平敲減。
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