結構生物學(xué)領(lǐng)域迎來(lái)“不結晶”革命

　　如果繼續發(fā)展下去，并且所有技術(shù)問(wèn)題都得到解決，冷凍電鏡確實(shí)會(huì )成為一種占據統治地位的技術(shù)，而不僅僅是第一選擇。

　　在英國劍橋市一座鋼結構建筑深處的地下室里，一場(chǎng)大規模的“叛亂”正在上演。

　　一個(gè)約3米高的龐大金屬箱正通過(guò)消失在屋頂上的橙色粗電纜，靜悄悄地發(fā)射兆兆字節的數據。這是全球最先進(jìn)的冷凍電子顯微鏡之一：一臺利用電子束為冷凍的生物分子成像并揭秘其分子形狀的設備。英國醫學(xué)研究委員會(huì )分子生物學(xué)實(shí)驗室(LMB)結構生物學(xué)家Sjors Scheres像個(gè)矮子一樣站在這臺價(jià)值500萬(wàn)英鎊(合770萬(wàn)美元)的設備旁邊介紹說(shuō)，這臺顯微鏡非常敏感，以至于一個(gè)叫喊聲就能毀掉試驗。

　　在全球實(shí)驗室中，類(lèi)似這樣的冷凍電鏡正影響著(zhù)結構生物學(xué)領(lǐng)域。過(guò)去3年里，它們揭示了制造蛋白的核糖體細節，而這些發(fā)現正在以飛快的速度發(fā)表于頂級期刊。結構生物學(xué)家們毫不夸張地認為，他們的領(lǐng)域正處于一場(chǎng)革命當中：冷凍電鏡能快速創(chuàng )建那些抗拒X射線(xiàn)結晶學(xué)和其他方法的分子的高分辨率模型。與此同時(shí)，利用此前技術(shù)獲得諾貝爾獎的實(shí)驗室正爭先恐后地學(xué)習這種“新貴”方法。

　　挑戰“王者”

　　當1973年生物學(xué)家Richard Henderson到LMB研究一種被稱(chēng)為菌視紫紅質(zhì)的蛋白時(shí)，利用光能量推動(dòng)質(zhì)子穿過(guò)細胞膜的X射線(xiàn)結晶學(xué)是毫無(wú)疑問(wèn)的“王者”。Henderson和他的同事Nigel Unwin利用這種蛋白制成二維晶體，但它們并不適合X射線(xiàn)衍射。因此，兩人決定嘗試電子顯微鏡。

　　當時(shí)，電子顯微鏡用于研究被重金屬染色劑處理過(guò)的病毒或組織切片。一束電子被射向樣品，其中掙脫開(kāi)來(lái)的電子被探測到并用于描繪它們所撞入的材料結構。這種方法產(chǎn)生了煙草病菌的首幅清晰圖像，但染色劑使觀(guān)察單個(gè)蛋白變得困難，更不用說(shuō)X射線(xiàn)所能揭示的原子水平上的細節。

　　在一個(gè)關(guān)鍵步驟中，當Henderson和 Unwin利用電子顯微鏡對菌視紫紅質(zhì)的晶片進(jìn)行成像時(shí)，他們省略了染色劑，相反把晶體放在金屬網(wǎng)格上，以便使蛋白凸顯出來(lái)�！澳隳芸吹降鞍字械脑�子�！焙蚒nwin在1975年發(fā)表了菌視紫紅質(zhì)結構的Henderson介紹說(shuō)�！斑@是一個(gè)巨大的進(jìn)步�！泵绹�加州大學(xué)舊金山分校細胞生物學(xué)家David Agard表示，“這就是說(shuō)，利用電子顯微鏡研究蛋白結構將成為可能�！�

　　冷凍電鏡領(lǐng)域在上世紀八九十年代得到發(fā)展。一個(gè)關(guān)鍵進(jìn)步是將液態(tài)乙烷用于瞬間凍結溶液中的蛋白并使其保持靜止。不過(guò)，通常情況下，這種技術(shù)仍然只能將蛋白結構解析到10埃(1埃相當于1納米的十分之一)的分辨率——與X射線(xiàn)晶體學(xué)超過(guò)4埃的模型相比并沒(méi)有競爭力，并且遠遠無(wú)法滿(mǎn)足將這些結構用于藥物設計的要求。當諸如美國國立衛生研究院等資助者把上億美元投資到野心勃勃的晶體學(xué)項目時(shí)，對冷凍電鏡的資助遠遠落后于此。

　　1997年，當Henderson參加關(guān)于3D電子顯微鏡的年度高登研究會(huì )議時(shí)，一位同事在開(kāi)幕式上發(fā)表了頗有挑釁意味的聲明：冷凍電鏡是一種“小生境”方法，不可能取代X射線(xiàn)晶體學(xué)。不過(guò)，Henderson能看到一個(gè)不同的未來(lái)，并且在隨后的演講中進(jìn)行了反駁�！爱敃r(shí)我說(shuō)，我們應當讓冷凍電鏡在全球統治所有結構學(xué)方法�！彼�回憶道。

　　革命從此開(kāi)始

　　此后第二年，Henderson、Agard和其他冷凍電鏡的狂熱支持者有條不紊地實(shí)現了各種技術(shù)改善，尤其是找到了感知電子的更好方法。在數碼相機風(fēng)靡世界很久之后，很多電子顯微鏡專(zhuān)家仍然偏好過(guò)時(shí)的膠片，因為它能比數字傳感器更高效地記錄電子。不過(guò)，和顯微鏡生產(chǎn)廠(chǎng)商一道，研究人員開(kāi)發(fā)出遠超膠片和數碼相機探測器的新一代直接電子探測器。

　　這些從2012年左右獲得應用的探測器，能以每秒幾十幀的速率捕捉單一分子的速射圖像。與此同時(shí)，諸如Scheres等研究人員編寫(xiě)了復雜的軟件程序，將上千幅2D圖像轉變成在很多情況下可與晶體學(xué)解析的分子圖像質(zhì)量相媲美的3D模型。

　　冷凍電鏡適合能忍受電子轟擊而不會(huì )四處晃動(dòng)的穩定、大型分子，因此通常由幾十個(gè)蛋白制成的分子機器是很好的目標。而研究證明，沒(méi)有什么比由RNA相互纏繞支撐的核糖體更加合適了。通過(guò)X射線(xiàn)晶體學(xué)解析核糖體結構的方法，讓3位化學(xué)家獲得了2009年諾貝爾化學(xué)獎。過(guò)去幾年里，不同的研究團隊迅速發(fā)表了來(lái)自眾多生物體的核糖體冷凍電鏡結構，包括首個(gè)人類(lèi)核糖體高分辨率模型。在由分享了2009年諾貝爾獎的Venki Ramakrishnan領(lǐng)導的LMB實(shí)驗室，X射線(xiàn)晶體學(xué)在很大程度上變得無(wú)人問(wèn)津。他認為，對于大型分子來(lái)說(shuō)，“冷凍電鏡將大幅取代晶體學(xué)技術(shù)的預測是可靠的”。

　　今年5月，加拿大多倫多大學(xué)結構生物學(xué)家John Rubinstein和他的同事利用約10萬(wàn)幅冷凍電鏡圖像，創(chuàng )建了一種名為V-ATPase、形狀類(lèi)似轉子的酶的“分子影片”。V-ATPase通過(guò)燃燒三磷酸腺苷(ATP)推動(dòng)質(zhì)子進(jìn)出細胞液泡�！拔覀兛吹降氖且磺惺虑槎荚陟`活進(jìn)行�！盧ubinstein說(shuō)，“它在彎曲、扭動(dòng)和變形�！痹谒�看來(lái)，這種酶的靈活性能幫助其高效傳遞ATP釋放的能量。

　　統治結構生物學(xué)領(lǐng)域

　　像任何新興領(lǐng)域一樣，冷凍電鏡領(lǐng)域也有著(zhù)成長(cháng)的煩惱。一些專(zhuān)家擔心，競相利用此項技術(shù)的研究人員會(huì )產(chǎn)生有問(wèn)題的結果。2013年發(fā)表的一種艾滋病病毒表面蛋白的結構，便受到科學(xué)家的質(zhì)疑。他們認為，用于構建模型的圖像是白噪聲。從那以后，雖然其他團隊產(chǎn)生的X射線(xiàn)和冷凍電鏡模型對原始模型提出了挑戰，但這些研究人員一直堅守他們的成果。

　　今年6月，在高登會(huì )議上，想要更多質(zhì)量控制的研究人員通過(guò)一項決議，督促各期刊為審稿人提供關(guān)于冷凍電鏡結構如何被創(chuàng )建的細節資料。

　　成本也會(huì )減緩此項技術(shù)的擴散。據Scheres估算，LMB每天花費約3000英鎊運行其冷凍電鏡設備，還要加上1000英鎊的電費。大部分電費是由儲存和處理圖像所需的計算機產(chǎn)生的�！皩τ诤芏鄬�(shí)驗室來(lái)說(shuō)，這是一項很高的開(kāi)支�！�

　　為了讓冷凍電鏡的使用更加便利，一些資助者建立了研究人員能預定時(shí)間的共享設備�；羧A德·休斯醫學(xué)研究所(HHMI)在其弗吉尼亞州珍利亞農場(chǎng)校區運營(yíng)著(zhù)一個(gè)對HHMI資助的研究人員開(kāi)放的冷凍電鏡實(shí)驗室。在英國，由政府和惠康基金會(huì )資助的一臺全國性冷凍電鏡設備，今年在牛津附近的迪德科特開(kāi)始運行�！叭藗兿胍�了解冷凍電鏡，已成為當下的一股浪潮�！睅椭�建立上述設備的倫敦大學(xué)伯克貝克學(xué)院結構生物學(xué)家Helen Saibil表示。

　　追趕這一浪潮的還有紐約洛克菲勒大學(xué)生物物理學(xué)家Rod MacKinnon。他因確定了特定離子通道的晶體結構而共同分享了2003年諾貝爾化學(xué)獎，但如今卻在深入研究冷凍電鏡�！拔艺�處在學(xué)習曲線(xiàn)的陡坡上，而這總是令我興奮不已�！盡acKinnon希望利用冷凍電鏡研究離子通道是如何打開(kāi)和關(guān)閉的。

　　當Henderson在1997年反駁說(shuō)冷凍電鏡將統治結構生物學(xué)世界時(shí)，他或許是在口是心非。但將近20年以后，他的預言已不像當時(shí)看上去的那么夸張�！叭绻�繼續發(fā)展下去，并且所有技術(shù)問(wèn)題都得到解決，冷凍電鏡確實(shí)會(huì )成為一種占據統治地位的技術(shù)，而不僅僅是第一選擇�！盚enderson說(shuō)，“我們或許已經(jīng)成功了一半�！�