結構生物學(xué)里程碑：低溫電子顯微鏡技術(shù)時(shí)代來(lái)臨

　　在劍橋大學(xué)一幢建筑的地下室里，一場(chǎng)技術(shù)革命正在醞釀。

　　一個(gè)笨重的、大約3米高的金屬盒子通過(guò)連接細胞的橙色纜線(xiàn)，安安靜靜地傳輸著(zhù)以萬(wàn)億字節計算的數據。這是世界上最先進(jìn)的低溫電子顯微鏡之一：低溫電子顯微鏡通過(guò)電子束對冷凍的生物分子進(jìn)行成像，從而得到分子的三維結構。站在這個(gè)耗資770萬(wàn)美金的儀器旁，英國醫學(xué)研究委員會(huì )分子生物學(xué)實(shí)驗室(UK Medical Research Council Laboratory of Molecular Biology, LMB)的結構生物學(xué)家 Sjors Scheres表示，低溫電子顯微鏡非常敏感，一聲喊叫就會(huì )帶來(lái)極大誤差，導致實(shí)驗失敗�！坝�國需要更多低溫電子顯微鏡，因為未來(lái)它會(huì )成為結構生物學(xué)的主流�！�

　　低溫電子顯微鏡震驚了結構生物學(xué)。過(guò)去30年里，低溫電子顯微鏡揭示了核糖體、膜蛋白和其它關(guān)鍵細胞蛋白的精細結構。這些發(fā)現都發(fā)表在頂級雜志上。結構生物學(xué)家們表示，毫不夸張地說(shuō)，低溫電子顯微技術(shù)正處于革命之中：低溫電子顯微鏡能夠快速生成高分辨率的分子模型，這一點(diǎn)遠超X射線(xiàn)晶體衍射等方法。依靠舊方法獲得諾獎的實(shí)驗室也在努力學(xué)習這一技術(shù)。這種新模型能夠準確地揭示細胞運行的必要機制，以及如何靶向針對疾病相關(guān)的蛋白。

　　“低溫電子顯微鏡能夠解決很多以前無(wú)法解決的謎題�！迸f金山加利福利亞大學(xué)(University of California)的結構生物學(xué)家David Agard這樣說(shuō)道。

　　幾年前Scheres被招進(jìn)LMB，任務(wù)是幫助改進(jìn)低溫電子顯微鏡，最終他成功了。上個(gè)月，他們發(fā)表了這個(gè)領(lǐng)域最令人振奮的成就：阿茲海默癥相關(guān)的酶的高清圖片，圖片包括該酶的1200左右個(gè)氨基酸，分辨率達到零點(diǎn)幾納米。

　　生物學(xué)家們如今仍在努力發(fā)展該技術(shù)，以期用它解決小分子或可變形分子的精微結構——這對低溫電子顯微鏡來(lái)說(shuō)，也是一大挑戰。來(lái)自加利福利亞大學(xué)(University of California)的結構生物學(xué)家Eva Nogales表示，叫它革命也好，飛躍也好，低溫電子顯微鏡的確打開(kāi)了一扇大門(mén)。

　　蛋白結晶

　　結構生物學(xué)領(lǐng)域有一條不成文的觀(guān)點(diǎn)：結構決定功能。只有知道生物分子的原子排布，研究者們才能了解這個(gè)蛋白的功能。例如，核糖體是如何根據mRNA的序列來(lái)制造蛋白，分子孔道是如何開(kāi)和關(guān)的。幾十年來(lái)，分析蛋白結構有一個(gè)無(wú)冕之王---X射線(xiàn)晶體衍射。在X射線(xiàn)晶體衍射中，科學(xué)家們讓蛋白結晶，接著(zhù)利用X射線(xiàn)照射，隨后根據X射線(xiàn)的衍射來(lái)重建蛋白的結構。在蛋白質(zhì)數據銀行(Protein Data Bank)的100,000多條蛋白詞目里，超過(guò)90%的蛋白結構是利用X射線(xiàn)晶體衍射技術(shù)解析得到的。很多諾貝爾獎也與這一技術(shù)相關(guān)，例如1962年揭示DNA雙鏈螺旋結構的諾獎。

　　盡管X射線(xiàn)晶體衍射一直是結構生物學(xué)家的最佳工具，但是它有較大的限制�？茖W(xué)家們可能需要幾年才能找到把蛋白形成大塊結晶的方法。而很多基礎蛋白分子，例如嵌在細胞膜上的蛋白，或是形成復合體的蛋白卻無(wú)法被結晶。

　　當Richard Henderson 1973年到LMB，研究菌視紫紅質(zhì)(一種利用光把質(zhì)子運進(jìn)膜內的蛋白)結構時(shí)，X射線(xiàn)晶體衍射是首選工具。Henderson和他的同事Nigel Unwin成功地做出了該蛋白的二維結晶，但卻不適用于X射線(xiàn)衍射。因此他們決定使用電子顯微鏡。

　　當時(shí)，電子顯微鏡主要用于研究用重金屬染過(guò)色的病毒或組織切片。一束光子打在樣本上，新生的電子被檢測到，被用于解析樣本結構。這種方法成功制作了第一幅病毒的精微圖片——一種煙草病毒。但染色導致無(wú)法看清各個(gè)蛋白，更不要說(shuō)原子細節了。Agarad表示，樣本上要么滿(mǎn)是斑點(diǎn)，要么沒(méi)染上，你只能看到分子的輪廓。

　　Herderson等人省略了染色的步驟，把菌視紫紅質(zhì)的單層晶體放到金屬網(wǎng)格中，然后用電子顯微鏡進(jìn)行成像。Agard表示，這個(gè)過(guò)程里，你看到的是蛋白的原子。這在當時(shí)是很大的進(jìn)步，因為當時(shí)人們都認為不可能利用電子顯微鏡解析蛋白結構。Henderson等人在1975年發(fā)表了這一成果。

　　20世紀80年代和90年代，低溫電子顯微鏡領(lǐng)域發(fā)展迅速。一個(gè)關(guān)鍵性突破是利用液態(tài)乙烷來(lái)快速冷凍蛋白溶液。這也是為什么叫低溫電子顯微鏡的原因。但這個(gè)技術(shù)的分辨率僅為1納米，遠遠達不到針對蛋白結構進(jìn)行藥物設計的需求。而當時(shí)X射線(xiàn)晶體衍射的分辨率能達到0.4納米。NIH等資助者投入了數億美金來(lái)支持蛋白晶體領(lǐng)域的發(fā)展，但對于低溫電子顯微鏡領(lǐng)域的資助卻很少。

　　1997年，Henderson參加了高登研究會(huì )議(Gordon Research Conference )關(guān)于3D電子顯微鏡的年會(huì )。一位同事以這樣的話(huà)做為開(kāi)幕致詞，“低溫電子顯微鏡技術(shù)非常有限，不可能超越X射線(xiàn)晶體衍射�！� 但Henderson的想法完全不同，在下一場(chǎng)發(fā)言中，他做出了反擊。Henderson指出，低溫電子顯微鏡會(huì )超越其它各種技術(shù)，成為全球研究蛋白結構的主流工具。

　　革命由此開(kāi)始

　　在此之后，Henderson等人致力于提高電子顯微鏡的性能——尤其是感知電子的靈敏度。在數碼相機席卷全球很多年后，很多電子顯微鏡學(xué)家仍然傾向于使用傳統的膠片，因為比起數碼感應器，膠片能更有效地記錄電子。與顯微鏡生產(chǎn)商合作時(shí)，研究者們發(fā)明了一種新的直接電子探測器，這種探測器的靈敏度遠高于膠片和數碼相機探測器。

　　大約在2012年，這種探測器能夠以一分鐘幾十幀的高速得到單個(gè)分子原子的連續圖像。同時(shí)，和Scheres一樣的研究者們精心編寫(xiě)了將多張2D圖片建成3D模型的軟件程序。這些3D圖像的畫(huà)質(zhì)可以媲美X射線(xiàn)晶體衍射獲得的圖像。

　　低溫電子顯微鏡適用于研究大的、穩定的分子，這些分子能夠承受電子的轟擊，而不發(fā)生變形——由多個(gè)蛋白組成的分子機器是最好的樣本。因此由RNA緊緊圍繞的核糖體是最佳的樣本。三位化學(xué)家用X射線(xiàn)晶體衍射研究核糖體溶液的工作在2009年獲得了諾貝爾化學(xué)獎，但這些工作花了幾十年。近幾年，低溫電鏡研究者們也陷入了“核糖體熱”。多個(gè)團隊研究了多種生物的核糖體，包括人類(lèi)核糖體的首個(gè)高清模型。X射線(xiàn)晶體衍射的研究成果遠遠落后于LMB的Venki Ramakrishnan實(shí)驗室，Venki獲得了2009年的諾獎。Venki表示，對于大分子來(lái)說(shuō)，低溫電子顯微鏡遠比X射線(xiàn)晶體衍射要實(shí)用。

　　這幾年，低溫電子顯微鏡的相關(guān)文章有很多：2015年一年，這個(gè)技術(shù)就用于100多個(gè)分子的結構研究。X-射線(xiàn)晶體衍射只能對單個(gè)、靜態(tài)的蛋白晶體成像，但低溫電子顯微鏡能夠對蛋白的多種構象進(jìn)行成像，幫助科學(xué)家們推斷蛋白的功能。

　　5月，多倫多大學(xué)(University of Toronto)結構生物學(xué)家John Rubinstein等人使用了100,000張低溫電子顯微鏡圖片來(lái)生成V-ATPase 的“分子電影”，V-ATPase的作用是消耗ATP，把質(zhì)子運進(jìn)運出細胞液泡�！蔽覀儼l(fā)現，這個(gè)酶非常靈活，可以彎折、扭曲和變型�！� Rubinstein說(shuō)道。他認為，這是由于這個(gè)酶的靈活性，它能夠高效地把ATP 釋放的能量傳遞到質(zhì)子泵。

　　2013年Nogales的團隊拼接了調控DNA轉錄成RNA的復合體的結構。他們發(fā)現，復合體的一個(gè)臂上懸掛著(zhù)緊繞DNA鏈的10納米結構，這段結構可能影響基因轉錄。Nogales表示，這個(gè)結構很漂亮，它可以幫助我們分析這個(gè)分子起作用的機制。

　　小而漂亮

　　現在低溫電鏡迅猛發(fā)展，專(zhuān)家們正在尋找更大的挑戰作為下一個(gè)解析目標。對很多人來(lái)說(shuō)，最想解析的是夾在細胞膜內的蛋白。這些蛋白是細胞信號通路中的關(guān)鍵分子，也是比較熱門(mén)的藥物靶標。這些蛋白很難結晶，而低溫電子顯微鏡不大可能對單個(gè)蛋白進(jìn)行成像，這是因為很難從背景噪音中提取這些信號。

　　這些困難都無(wú)法阻擋加利福利亞大學(xué)(University of California)的生物物理學(xué)家程亦凡。他計劃解析一種細小的膜蛋白TRPV1。TRPV1是檢測辣椒中引起灼燒感的物質(zhì)的受體，并與其它痛感蛋白緊密相關(guān)。加利福利亞大學(xué)病理學(xué)家David Julius等人之前嘗試結晶TRPV1，結果失敗。用低溫電子顯微鏡解析TRPV1項目，一開(kāi)始進(jìn)展緩慢。但2013年底，技術(shù)進(jìn)步使得這一項目有了重大突破，他們獲得了分辨率為0.34納米的TRPV1蛋白的結構。該成果的發(fā)表對于領(lǐng)域來(lái)說(shuō)，無(wú)異于驚雷。因為這證實(shí)了低溫電子顯微鏡能夠解析小的、重要的分子�！爱斘铱吹絋RPV1的結構時(shí)，我激動(dòng)得一晚上睡不著(zhù)覺(jué)�！盧ubinstein說(shuō)道。

　　研究者們可能面臨更多這樣無(wú)眠的夜晚。Agard表示，會(huì )有更多膜蛋白相繼被解析出來(lái)。

　　上個(gè)月由Scheres和清華大學(xué)的結構生物學(xué)家施一公合作發(fā)表的一篇文章就成功解析了一個(gè)膜蛋白。他們建立了γ-分泌酶的模型，γ-分泌酶負責合成與阿茲海默癥相關(guān)的β-淀粉斑。0.34納米分辨率的圖譜顯示，比較少見(jiàn)的遺傳性阿爾茨海默病的γ-分泌酶突變后會(huì )在圖譜上呈現兩個(gè)“熱點(diǎn)”(突變或者重組頻率顯著(zhù)增加的位點(diǎn))，并且這種突變最終會(huì )合成有毒性的β-淀粉斑。γ-分泌酶的結構圖幫助研究者發(fā)現為什么以往的抑制劑會(huì )無(wú)效，從而促進(jìn)新藥的研發(fā)。程亦凡表示，γ-分泌酶的結構非常驚人。

　　類(lèi)似的成功吸引了制藥公司的注意。他們希望借助低溫電子顯微鏡去解析那些無(wú)法結晶的蛋白，從而更好地研發(fā)藥物。Scheres如今和輝瑞公司合作，攻克離子通道。離子通道包含很多膜蛋白，例如痛感受分子和神經(jīng)遞質(zhì)受體�！拔規缀醣幻恳粋�(gè)人聯(lián)系過(guò)�！盢ogales這樣說(shuō)道。

　　盡管低溫電子顯微鏡發(fā)展迅速，很多研究者認為，它仍有巨大提升空間。他們希望能制造出更靈敏的電子探測器，以及更好地制備蛋白樣本的方法。這樣的話(huà)，就能夠對更小的、更動(dòng)態(tài)的分子進(jìn)行成像，并且分辨率更高。5月，有研究者發(fā)表了一篇細菌蛋白的結構，分辨率達到了0.22納米。這也顯示了低溫顯微鏡的潛力。

　　與任何熱門(mén)領(lǐng)域一樣，低溫電子顯微鏡的發(fā)展也有煩惱。一些專(zhuān)家擔心研究者們盲目追求該儀器會(huì )誘發(fā)一些問(wèn)題。2013年HIV表面蛋白的結構圖遭到了科學(xué)家們的質(zhì)疑，他們認為用于建模的圖片很多都是白噪聲。此后，其他團隊得到的X射線(xiàn)晶體衍射和低溫電子顯微鏡模型也對原模型提出了質(zhì)疑。但這些研究者們堅持相信自己的結果。今年6月，在高登研究會(huì )議(Gordon Research Conference )上，研究者們希望低溫電子顯微鏡的結構圖要有嚴格的質(zhì)量控制。并且雜志要求作者們提供詳細的建模方法。

　　成本問(wèn)題可能會(huì )限制低溫電子顯微鏡的推廣。Scheres估計，LMB每天用于支持低溫電子顯微鏡的經(jīng)費就達到近3萬(wàn)人民幣，外加近1萬(wàn)的電費——這是由于存儲和處理圖片的電腦耗電量很大。Scheres表示，每天至少要花費近4萬(wàn)人民幣，對于很多地方來(lái)說(shuō)，這個(gè)費用太高。為了推廣低溫電子顯微鏡，很多基金會(huì )建立了對外公開(kāi)的設備，各地研究者們可以預約使用�；羧A德·休斯醫學(xué)研究所(Howard Hughes Medical Institute, HHMI)在珍利亞農場(chǎng)研究園區配備了一臺。這臺設備對所有HHMI資金的研究者公開(kāi)。在英國，政府和維康信托在牛津大學(xué)附近建立了低溫電鏡公開(kāi)使用平臺。參與該平臺搭建的倫敦大學(xué)(University of London)的結構生物學(xué)家Helen Saibil表示，有很多人想學(xué)習使用低溫電鏡。

　　洛克菲勒大學(xué)(Rockefeller University)的生物物理學(xué)家Rod MacKinnon就是這些人之一。他在2003年因解析一些離子通道的結晶結構而獲得諾貝爾獎。MacKinnon現在對低溫電鏡非常著(zhù)迷�！拔椰F在處于學(xué)習曲線(xiàn)的斜坡階段，非常熱切�！� MacKinnon這樣說(shuō)道。他打算用低溫電鏡來(lái)研究離子通道是如何開(kāi)和關(guān)的。

　　1997年時(shí)，Henderson非常堅定地宣稱(chēng)，低溫電鏡會(huì )成為解析蛋白結構的主流工具。在將近20年后的今天，他的預測比當年有了更多底氣。Henderson表示，如果低溫電鏡保持這樣的勢頭繼續發(fā)展，技術(shù)問(wèn)題也得以解決，那么低溫電鏡不僅會(huì )成為解析蛋白結構的第一選擇，而是主流選擇。這個(gè)目標已經(jīng)離我們不遠了。