基因芯片及其最新進(jìn)展

　　80年代中期，俄羅斯科學(xué)院恩格爾哈得分子生物學(xué)研究所和美國阿貢國家實(shí)驗室(ANL)的科學(xué)家們最早在文獻中提出了用雜交法測定核酸序列 (SBH)新技術(shù)的想法。當時(shí)用的是多聚寡核酸探針。幾乎與此同時(shí)英國牛津大學(xué)生化系的Sourthern等也取得了在載體固定寡核苷酸及雜交法測序的國際專(zhuān)利。

　　基因芯片利用微電子、微機械、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、新型材料、計算機和統計學(xué)等多學(xué)科的先進(jìn)技術(shù),實(shí)現了在生命科學(xué)研究中樣品處理、檢測和分析過(guò)程的連續化、集成化和微型化。

　　1997年世界上第一張全基因組芯片——含有6166個(gè)基因的酵母全基因組芯片在斯坦福大學(xué)Brown實(shí)驗室完成，從而使基因芯片技術(shù)在世界上迅速得到應用。

　　基因芯片技術(shù)主要包括四個(gè)基本要點(diǎn)：芯片方陣的構建、樣品的制備、核酸分子反應和信號的檢測。1、芯片制備，先將玻璃片或硅片進(jìn)行表面處理，然后使核酸片段按順序排列在芯片上。2、樣品制備，可將樣品進(jìn)行生物處理，獲取其中的DNA、RNA，并且加以標記，以提高檢測的靈敏度。3、生物分子反應，芯片上的生物分子之間的反應是芯片檢測的關(guān)鍵一步。通過(guò)選擇合適的反應條件使樣品中的核酸分子與芯片上的核酸分子反應處于最佳狀況中，減少錯配比率。4、芯片信號檢測，常用的芯片信號檢測方法是將芯片置入芯片掃描儀中，通過(guò)掃描以獲得有關(guān)生物信息。

　　基因芯片技術(shù)發(fā)展的最終目標是將從樣品制備、雜交反應到信號檢測的整個(gè)分析過(guò)程集成化以獲得微型全分析系統(micro total analytical system)或稱(chēng)縮微芯片實(shí)驗室(laboratory on a chip)。使用縮微芯片實(shí)驗室，就可以在一個(gè)封閉的系統內以很短的時(shí)間完成從原始樣品到獲取所需分析結果的全套操作。

　　近年,基因芯片技術(shù)在疾病易感基因發(fā)現、疾病分子水平診斷、基因功能確認、多靶位同步超高通量藥物篩選以及病原體檢測等醫學(xué)與生物學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應用。

　　一、第一代基因芯片

　　第一代基因芯片基片可用材料有玻片、硅片、瓷片、聚丙烯膜、硝酸纖維素膜和尼龍膜,其中以玻片最為常用。為保證探針?lè )�定固定于載體表面,需要對載體表面進(jìn)行多聚賴(lài)氨酸修飾、醛基修飾、氨基修飾、巰基修飾、瓊脂糖包被或丙烯酰胺硅烷化,使載體形成具有生物特異性的親和表面。最后將制備好的探針固定到活化基片上,目前有兩種方法:原位合成和合成后微點(diǎn)樣。根據芯片所使用的標記物不同,相應信號檢測方法有放射性核素法、生物素法和熒光染料法,在以玻片為載體的芯片上目前普遍采用熒光法。

　　相應熒光檢測裝置有激光共聚焦顯微鏡、電荷偶合器( charge coup led devices, CCD)、激光掃描熒光顯微鏡和激光共聚焦掃描儀等。其中的激光共聚焦掃描儀已發(fā)展為基因芯片的配套檢測系統。經(jīng)過(guò)芯片掃描提取雜交信號之后,在數據分析之前,首先要扣除背景信號,進(jìn)行數據檢查、標化和校正,消除不同實(shí)驗系統的誤差。

　　對于簡(jiǎn)單的檢測或科學(xué)實(shí)驗,因所需分析基因數量少,故直接觀(guān)察即可得出結論。若涉及大量基因尤其是進(jìn)行表達譜分析時(shí),就需要借助專(zhuān)門(mén)的分析軟件,運用統計學(xué)和生物信息學(xué)知識進(jìn)行深入、系統的分析,如主成分分析、分層聚類(lèi)分析、判別分析和調控網(wǎng)絡(luò )分析等。

　　芯片數據分析結束并不表示芯片實(shí)驗的完成,由于基因芯片獲取的信息量大,要對呈數量級增長(cháng)的實(shí)驗數據進(jìn)行有效管理,需要建立起通行的數據儲存和交流平臺,將各實(shí)驗室獲得的實(shí)驗結果集中起來(lái)形成共享的基因芯片數據庫,以便于數據的交流及結果的評估。

　　1、引物設計

　　SYBR Green可與所有的雙鏈DNA反應(包括引物二聚體)，為了使擴增反應集中于目的基因，避免非特異性擴增，引物設計成為關(guān)鍵因素。為得到單一特異的擴增產(chǎn)物，避免擴增出序列相似的非特異性產(chǎn)物，采用BLAST或者其他比對方法，檢測引物在相應物種(如人，小鼠或大鼠)全基因組中的特異性。為了保證在相同的PCR條件下(特別是統一的退火溫度)，不同基因均能擴增出相應的特異性產(chǎn)物，對引物的CG值，解鏈溫度(Tm)，以及其他化學(xué)和物理的特性都進(jìn)行了優(yōu)化調整。為了獲得高擴增效率，對擴增片段的長(cháng)度也進(jìn)行了優(yōu)化，一般為100到200bp，確保在統一的循環(huán)反應的時(shí)間范圍內，不同基因均能擴增出完整片段。

　　2、反應體系

　　為避免非特異性擴增，使用化學(xué)修飾的熱啟動(dòng)Taq酶，只有經(jīng)過(guò)熱激步驟，Taq酶才能發(fā)揮擴增活性。同時(shí)，反應體系經(jīng)過(guò)優(yōu)化，可最大限度減少引物二聚體形成，并且保證較難擴增的片段都得到極高的擴增效率。

　　3、定量結果可靠

　　在標準的96孔PCR反應儀中進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗，為了獲得高通量，無(wú)法為每個(gè)樣品單獨制備標準曲線(xiàn)。在完全相同的PCR反應條件下，希望表達量不同的多個(gè)基因均獲得可靠的結果，需要確保每個(gè)基因都有較高的擴增效率，從而可采用簡(jiǎn)單的△△Ct方法計算基因表達量。

　　其靈敏度高，樣品的使用量低，每張芯片使用的總RNA最少可為0.5ng;可觀(guān)察到的動(dòng)態(tài)線(xiàn)性范圍超過(guò)105，可以同時(shí)檢測表達量差異較大的基因;Ct值的平均差異只有0.25個(gè)循環(huán)，可檢測超過(guò)兩倍的基因表達量變化。因此，第二代功能分類(lèi)基因芯片是研究特定信號通路或者一組功能相關(guān)基因表達量的理想方法。

　　二、第二代基因芯片

　　盡管基因芯片技術(shù)已經(jīng)取得了長(cháng)足的發(fā)展，但仍然存在著(zhù)許多難題和不足。目標分子的標記是重要的限速步驟，如何繞過(guò)這一步是人們一直期望解決的問(wèn)題。其次是檢測靈敏度不高，重復性差，無(wú)法檢測單堿基錯配的基因樣品。再者，待檢測的基因樣品必須經(jīng)過(guò)PCR擴增技術(shù)的處理以獲得足夠量的待檢測樣品，使檢測過(guò)程相對復雜。我們稱(chēng)具備以上特征的基因芯片技術(shù)為第一代基因芯片技術(shù)，這些特征充分說(shuō)明基因芯片技術(shù)本身存在著(zhù)較大的發(fā)展空間。

　　第二代基因芯片包括如下幾種：

　　1. 電極陣列型基因芯片：將微電極在襯底上排成陣列，通過(guò)對氧化還原指示劑的電流信號的檢測實(shí)現基因序列的識別;

　　2. 非標記熒光指示基因芯片：利用熒光分子作為雜交指示劑，在不需對靶基因進(jìn)行熒光標記的前提下，通過(guò)對熒光分子的檢測實(shí)現基因序列的識別;

　　3. 量子點(diǎn)指示基因芯片：利用量子點(diǎn)作為雜交指示劑，在不需對靶基因進(jìn)行熒光標記的前提下，通過(guò)對量子點(diǎn)的掃描實(shí)現基因序列的識別;

　　4. 分子燈塔型基因芯片：利用探針DNA片斷的發(fā)夾結構，獲得單堿基突變檢測的能力。

　　三、第三代基因芯片

　　目前，眾多的第三代基因芯片現在也推向了市場(chǎng)。第三代基因芯片代表了測序的最高水平和未來(lái)走向。

　　1、Illumina微珠基因芯片技術(shù)

　　這是Illumina公司核心技術(shù)之一，博奧生物基于Illumina微珠芯片平臺，推出SNP分型檢測服務(wù)以及定制SNP分型檢測服務(wù)。

　　它首先用微機電技術(shù)在光纖末端或硅片基質(zhì)上蝕刻出微孔(深度約為3毫米的相同凹槽)，將“微珠池“內的微珠“倒”入光纖束微孔，每個(gè)微孔恰可容納一個(gè)微珠，在范德華力和與微孔壁間流體靜力學(xué)相互作用下，微珠以“無(wú)序自組裝”的方式在微孔內組裝成芯片。每種類(lèi)型的微珠平均有 30 倍左右的重復。

　　每一個(gè)微珠上都偶聯(lián)有80萬(wàn)左右拷貝數的探針。每一個(gè)探針由特異的地址序列(對每種微珠進(jìn)行解碼，29mer)和特異序列(代表不同的檢測信息，如 SNP 位點(diǎn)序列、基因序列等)組成。用專(zhuān)利的解碼技術(shù)對芯片上的微珠進(jìn)行解碼，完成對芯片微珠定位信息的收集和確認，也實(shí)現芯片生產(chǎn)過(guò)程中100%質(zhì)控。

　　以四種熒光標記進(jìn)行16種微珠解碼為例，解碼過(guò)程使用與地址序列互補的且分別標記4種熒光染料的探針進(jìn)行。把標記4種熒光的不同地址序列探針進(jìn)行組合，每次雜交后探針清洗下來(lái)進(jìn)行下一輪雜交，通過(guò)多輪雜交達到指數型區分能力。

　　2、Ion Torrent半導體基因芯片

　　Ion Torrent半導體基因芯片是最新一代的測序技術(shù)，它的問(wèn)世給測序技術(shù)的應用帶來(lái)了激動(dòng)人心的進(jìn)展。它采用了半導體技術(shù)和簡(jiǎn)單的化學(xué)試劑進(jìn)行DNA測序，而不是使用光作為媒介。在半導體芯片的微孔中固定DNA鏈，隨后依次摻入ATCG。隨著(zhù)每個(gè)堿基的摻入，釋放出氫離子，在它們穿過(guò)每個(gè)孔底部時(shí)能被檢測到，通過(guò)對H+的檢測，實(shí)時(shí)判讀堿基。

　　Ion Torrent個(gè)人化操作基因組測序儀(PGMTM)是第一臺基于半導體技術(shù)的測序儀。與其他測序技術(shù)相比，使用該項技術(shù)的測序系統更簡(jiǎn)單、更快速、及更易升級。該測序儀與其他高通量測序儀特征互補，可以迅速完成應急服務(wù)項目，縮短服務(wù)周期，增加服務(wù)效率。

　　3、實(shí)時(shí)單分子測序基因芯片

　　太平洋生物科學(xué)公司(PacBio)實(shí)時(shí)單分子測序基因芯片是直接測由DNA聚合酶將熒光標記的核苷酸摻入互補測序模板。該技術(shù)的核心是一個(gè)零點(diǎn)啟動(dòng)模式的波導(Zero-mode Wavelength，ZMW)納米結構的密集排列， 這一排列陣可以進(jìn)行單個(gè)熒光分子的光學(xué)審視。

　　在過(guò)去，零點(diǎn)啟動(dòng)模式波導結構被用于從大量高密度的分子中分辨出單一的熒光分子，還沒(méi)有被用于大量平行分析的操作。為使之用于大量平行分析和數據輸出通量(測序數據生成能力)，太平洋生物科學(xué)公司開(kāi)發(fā)出一種方法，能有效地將零點(diǎn)啟動(dòng)模式波導結構排到表面上，他們采用了電子束光刻技術(shù)(Electron beam Lithography)和紫外光電子束光刻技術(shù)(Ultraviolet Photo lithography) 以及高度平行的共焦成像系統， 這樣可以對零點(diǎn)啟動(dòng)模式納米結構中的熒光標記分子進(jìn)行高靈敏度和高分辨率的探測，并采用了一個(gè)沉重的穩定平臺來(lái)確保良好的光學(xué)聚焦效果。

　　4、納米球基因芯片

　　全基因組學(xué)公司(Complete Genomics)的納米球基因芯片是以雜交和連接反應為核心的。當通過(guò)雜交和連接進(jìn)行測序的方法出現以后，全基因組學(xué)公司推出了新的樣品處理方法和納米陣列平臺�；�因組DNA首先經(jīng)過(guò)超聲處理，再加上一些接頭，然后模板環(huán)化，酶切。最后產(chǎn)生大約400個(gè)堿基的環(huán)化的測序片段，每個(gè)片段內含有4個(gè)明確的接頭位點(diǎn)。環(huán)化片段用Φ29聚合酶擴增2個(gè)數量級。一個(gè)環(huán)化片段所產(chǎn)生的擴增產(chǎn)物稱(chēng)為DNA納米球(DAN nanoball, DNB)。納米球被選擇性地連接到六甲基二硅氮烷處理的硅芯片上。

　　5、納米孔基因芯片技術(shù)

　　另外，還在發(fā)展中的納米孔基因芯片技術(shù)是很有潛力的第四代技術(shù)。因為這種方法不再需要光學(xué)檢測和同步的試劑洗脫過(guò)程了。

　　這是一種基于納米孔(納米洞)結構的完全不同的測序技術(shù)，單個(gè)堿基的讀取可以靠測定經(jīng)由納米級別的孔洞而跨越或透過(guò)薄膜的電導率來(lái)進(jìn)行。納米孔技術(shù)可以廣泛地歸納為兩類(lèi)：生物類(lèi)和固態(tài)類(lèi)。

　　α溶血素是一種能天然性地連接到細胞膜中繼而導致細胞溶解的蛋白質(zhì)，它第一個(gè)被用來(lái)做成生物納米孔模型。第二類(lèi)納米孔是以硅及其衍生物進(jìn)行機械制造而成。 使用這些合成的納米孔可以降低在膜穩定性和蛋白定位等方面的麻煩，而這些正是牛津納米孔公司所創(chuàng )立的生物納米孔系統一直遇到的問(wèn)題。

　　例如，Nabsys就發(fā)明了一套系統，他們以匯聚的離子束將硅片薄膜打成納米孔，用于檢測與特異性引物進(jìn)行了雜交的單鏈DNA穿過(guò)納米孔時(shí)的阻斷電流變化。 IBM創(chuàng )建了一個(gè)更為復雜的系統，能有效地使DNA位移暫停，并在暫停的時(shí)候通過(guò)隧道電流檢測識別每個(gè)堿基。