高效液相色譜發(fā)展現狀及前景

　　液相色譜分析是指流動(dòng)相為液體的色譜技術(shù),是色譜法中最古老的一種,但通過(guò)改進(jìn)填料的粒度及柱壓,在經(jīng)典的液相柱色譜的基礎上引入了氣相色譜的塔板理論,在技術(shù)上采用了高壓輸液泵,高效固定相和高靈敏度的檢測器,實(shí)現了分析速度快、分離效率高和操作自動(dòng)化,這種色譜技術(shù)被稱(chēng)為高效液相色譜法(HighperformanceliquidchromatographyHPLC)。中藥的成分非常復雜,以往常用的薄層色譜等方法因其精密度、準確度、靈敏度、重現性差而不能滿(mǎn)足現代中藥的需要。高效液相色譜正是以其穩定、可靠、高效的特點(diǎn)成為中藥研究的最重要的分析方法。目前高效液相色譜已經(jīng)廣泛應用于生物堿、皂苷、黃酮、蒽醌、香豆素等各種中藥有效成分的測定。近年來(lái)對高效液相色譜監測中藥的研究非常多,由于高效液相色譜集經(jīng)典液相色譜和氣相色譜的優(yōu)勢于一身,無(wú)論柱效、選擇性還是分析程度都達到或超過(guò)了它們,近年來(lái)對高效液相色譜的不足之處進(jìn)行了改進(jìn),使這項技術(shù)日臻完善。

　　1高效液相色譜發(fā)展近況

　　高效液相色譜在藥物分析中的應用,主要考慮試樣的預處理和分析柱、檢測器的選擇。在試樣的預處理上,日前興起的固相(微)萃取使得許多含量低的成分得到精制提純,從而適于高效液相色譜的測定,而孫新國采用逆流萃取測定川芎嗪含量取得了很好的效果。中藥中有些紫外吸收弱,或無(wú)特征紫外吸收的成分,直接用高效液相色譜測定,其靈敏度和分離度都不盡人意,利用柱前或柱后衍生化法可使這些成分較精確地測定出來(lái)。對于極性大、脂溶性差物質(zhì),在YWGCl8柱上不易保留,用十二烷基磺酸鈉作為離子對試劑,降低其極性,延長(cháng)柱上的保留時(shí)間,取得較好的分離較果。將液相色譜和質(zhì)譜這兩個(gè)強有力的分析技術(shù)在線(xiàn)連接在一起,經(jīng)過(guò)三十年的發(fā)展已成為一項較為成熟的分析手段,但是它從形成伊始就存在著(zhù)問(wèn)題:從液相色譜流進(jìn)質(zhì)譜時(shí),流動(dòng)相的變化、溶劑的組成、高溫高壓離子化的問(wèn)題制約著(zhù)這種聯(lián)用技術(shù)發(fā)展,大氣壓離子化接口具有去除溶劑和離子化的雙重功效,它的引入,使得該技術(shù)在各個(gè)領(lǐng)域得到了廣泛的應用。電噴霧離子源是一種軟電離技術(shù),一般只生成(M H) 和(M-H)-兩種分子離子峰,選擇性監測(mz)190的負分子離子峰,具有較高的靈敏度、準確度、專(zhuān)一性,滿(mǎn)足了低濃度藥物研究的需求。由張莉等人研究的三維高效液相色譜法可以同步測定葛根素和阿魏酸兩種指標。通過(guò)實(shí)驗證明:如果選擇合適的柱溫等色譜條件,乙醇作為反相高效液相色譜流動(dòng)相,分析中藥及中成藥中有效成分,既安全又準確。結構相似的物質(zhì),普通的檢測器難以檢測出來(lái),高效液相色譜-電化學(xué)法可以有效地測定黃連粉中僅差一個(gè)基團的黃芩苷和黃芩素的含量。樣品經(jīng)色譜柱分離后收集,再經(jīng)熒光分光光度計測熒光強度,影響因素多,測定復雜,改進(jìn)后的高效液相色譜-熒光法則可以不經(jīng)衍生化和收集分離物,只經(jīng)化學(xué)處理除雜,濃縮后直接進(jìn)樣即可。用該法測定貫葉連翹中金絲桃素的含量也取得了較好的結果。高效液相色譜-示差折光測黃芪精口服液中黃芪甲苷的含量也都取得了較為滿(mǎn)意的結果。對于只有紫外末端吸收,用紫外檢測時(shí)靈敏度低,基線(xiàn)易漂移,示差折光檢測其易受外界條件干擾,蒸發(fā)散射檢測器能克服以上不足,響應值只與樣品質(zhì)量有關(guān),其信號相應與質(zhì)量成正比,不同化合物,質(zhì)量相同則信號相應基本一致。蒸發(fā)光散射檢測法是基于不揮發(fā)樣品分子對光的散射程度與其質(zhì)量成正比,與其所含基團性質(zhì)無(wú)關(guān)。只要選擇適當的檢測器參數,便可使流動(dòng)相和溶劑完全氣化,不產(chǎn)生信號,而樣品中的各個(gè)組分以不揮發(fā)粒子存在,對光有散射,以被檢測出來(lái)。因此,蒸發(fā)光散射檢測器可用于含不同基團的多組分同時(shí)分離、分析。和紫外、熒光等方法相比,蒸發(fā)光散射檢測法對不同物質(zhì)有近似相同的響應因子,

　　因而不出現低濃度、高響應或高濃度、低響應的現象,有利于不同比例混合物的準確測定.高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢驗法測定銀杏葉中萜類(lèi)內酯含量、紅參及育精膠囊中人參

　　皂苷Rg1和Re的含量和藤黃中藤黃酸含量都得到了很好的結果。

　　2高效液相色譜的研究動(dòng)向

　　2.1縮短分析時(shí)間,提高分離效率。應用先進(jìn)的檢測儀器和方法,對流動(dòng)相、固定相進(jìn)行調節或改變,采用梯度洗脫、柱切換技術(shù)有望解決這個(gè)問(wèn)題。梯度洗脫的高效液相色譜法,能分析較寬極性范圍的樣品,較等度洗脫具有很大的優(yōu)勢,但對于成分更復雜、極性范圍更寬的中藥樣品則有些力不從心。多柱高效液相色譜法又稱(chēng)多維高效液相色譜法。除具有梯度洗脫一樣的改變流動(dòng)相濃度的優(yōu)點(diǎn)外,還可以改變固定相種類(lèi)、鍵合度、粒徑、柱長(cháng)、柱徑等及流動(dòng)相種類(lèi)、濃度等。

　　2.2進(jìn)一步向自動(dòng)化、智能化及聯(lián)用技術(shù)上發(fā)展。液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用在國外已成為測定低濃度生物藥品中藥物及代謝物的首選方法,LC-MS-MS法測定血漿中HIV-1蛋白酶,準確高效,血漿中殘留的內源性組份和其他藥物不干擾測定,既節省材料又節約時(shí)間。已經(jīng)應用于體液、血漿、血清中的藥物分析。中藥復方注射液“清開(kāi)靈”中的膽酸類(lèi)物的分析采用液相色譜質(zhì)譜質(zhì)譜聯(lián)用,效果理想。高效液相色譜-核磁共振聯(lián)用在藥物分析方面的作用很不錯。新近提出的智能多柱高效液相色譜系統利用切換技術(shù)的模塊式分離性能,把樣品分塊的切換進(jìn)不同性質(zhì)的色譜柱,再用合適的流動(dòng)相洗脫。全過(guò)程采用智能化控制。

　　3高效液相色譜在中藥分析中的應用前景

　　中藥研究的大趨勢是全成分分析,通過(guò)對從單味藥到復方的不同配伍、煎煮時(shí)間等的研究,才能發(fā)現中藥中化學(xué)成分的變化規律,找到中藥機理之間的有機聯(lián)系。中藥成分繁多,且各種成分的性質(zhì)遍布所有極性段、酸堿范圍。實(shí)現多成分分析的最簡(jiǎn)單途徑即在一根足夠長(cháng)的色譜柱上,采用溫和的流動(dòng)相,在足夠久的時(shí)間內洗脫。但這與現代分析要求的簡(jiǎn)便快速相違。通過(guò)大量的應用研究表明,高效毛細管電泳在分析中藥成分,尤其在分析高極性化學(xué)成分方面有較大優(yōu)勢,在分析大量的復方制劑方面顯示了較高的能力。由于毛細管幾乎不會(huì )出現高效液相色譜分析中常出現的柱床污染現象,而且用過(guò)的毛細管柱只需很短的時(shí)間進(jìn)行沖洗后,即可以進(jìn)行第二個(gè)樣品的分析,快速高效且分辨率很高。新興的毛細管電色譜是集高效液相色譜和毛細管電泳優(yōu)勢于一身的一種新型電分離微柱液相色譜技術(shù),它是將高效液相色譜的多種填料微粒移到毛細管中,以樣品與固定相間的相互作用作為分離機制,以電滲流為流動(dòng)相驅動(dòng)力的色譜過(guò)程。最近,一些先進(jìn)的檢測儀器成功的用在了高效液相色譜分析法上,使得高效液相色譜的應用更廣泛,并充分利用高效快速、選擇性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn),建立更加系統的成分分析方法。通過(guò)與質(zhì)譜聯(lián)用、梯度洗脫、柱切換技術(shù)、配合先進(jìn)的檢測技術(shù),以及與分子生物學(xué)、現代分子藥理學(xué)相結合,必將在中藥分析中發(fā)揮很大作用。