PCR實(shí)驗原理及反應要素介紹

二、實(shí)驗原理

    類(lèi)似于DNA的體內復制。

首先待擴增DNA模板加熱變性解鏈，隨之將反應混合物冷卻至某一溫度，這一溫度可使引物與它的靶序列發(fā)生退火，再將溫度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。這種熱變性-復性-延伸的過(guò)程就是一個(gè)PCR循環(huán)。

PCR過(guò)程是由變性，退火，延伸3個(gè)步驟組成的不斷重復的過(guò)程。標準的PCR過(guò)程分為三步：

1.DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DN

2.退火（復性）（40℃-65℃）：系統溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈。

3.3.延伸（68℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′ 端延伸，合成與模板互補的DNA鏈。

每一循環(huán)經(jīng)過(guò)變性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。

三、PCR反應要素：

1. DNA模版：可以是雙鏈、單鏈、提取染色體的DNA、克隆的質(zhì)粒DNA，
2. 引物：一對寡聚DNA，分別與模板兩側的3’端序列互補，可使DNA序列得到擴增
3. DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）：催化DNA合成，
4. 緩沖液：提供DNA合成反應所需的PH,離子強度等環(huán)境
5. 4種單核苷酸：dNTP,提供DNA合成原料

• 實(shí)驗材料

     PCR擴增儀、PCR反應管、PCR離心管、移液器、凝膠電泳設備、冰盒、離心機

     模板、PCR引物、TaqDNA聚合酶、dNTP反應緩沖液、Mg2+、ddH2O。

• PCR反應體系

1.   以DNA為模板的反應體系：

  模板：DNA102~105拷貝

  引物

  底物：4種dNTP

  TaqDNA聚合酶

  緩沖液

  體積：

1.   以mRNA為模板的反應（逆轉錄PCR）

  模板：RNA

  引物：oligo(dT)12~18

  底物：4種dNTP

  逆轉錄酶

  緩沖液

  其他試劑：RNA酶抑制劑，MgCl2.DTT.