熒光定量PCR常用術(shù)語(yǔ)

基線(xiàn)：基線(xiàn)是早期循環(huán)的噪點(diǎn)水平，通常在第3和第15循環(huán)之間測量，這是因為在此期間還檢測不到擴增產(chǎn)物引起的熒光值增加。用于計算基線(xiàn)的循環(huán)數量是可以改變的，如果使用高模板量或者靶標基因的表達水平高則循環(huán)數量需要減少。設置基線(xiàn)需要查看線(xiàn)性度擴增曲線(xiàn)的熒光數據。設置基線(xiàn)，使得擴增曲線(xiàn)的增長(cháng)所開(kāi)始的循環(huán)圈數大于基線(xiàn)循環(huán)最高圈數。對每個(gè)靶標序列都需要單獨設置基線(xiàn)。早期循環(huán)檢測到的平均熒光值需要從擴增產(chǎn)物中獲得的熒光值中減去。各種real-timePCR軟件的最新版本允許單個(gè)樣品自動(dòng)優(yōu)化基線(xiàn)設置。

本底：是指反應中的非特異性熒光值，例如，低效率的熒光淬滅，或由于使用SYBR Green造成的大量雙鏈DNA模板。信號的本底分量由real-time PCR軟件算法數學(xué)除去。

報告基因信號 ：在real-time PCR過(guò)程中由SYBR Green或熒光標記的序列特異性探針產(chǎn)生的熒光信號。

歸一化報告信號（RN）：這是報告染料熒光強度除以在每個(gè)循環(huán)中測量的被動(dòng)參照染料的熒光強度。

被動(dòng)參比染料 ：在某些real-time PCR中，熒光染料ROX被用作熒光信號標準化內部參照。它可以逐孔校正因校正因移液不準確、孔位置及熒光波動(dòng)造成的變動(dòng)。

閾值：閾值調整到本底值之上并顯著(zhù)低于擴增曲線(xiàn)的平穩值。它必須處于擴增曲線(xiàn)的線(xiàn)性區域內，代表了PCR檢出的對數線(xiàn)性范圍。閾值應在對數擴增曲線(xiàn)視圖中進(jìn)行設置，以使PCR的對數線(xiàn)性期易于識別。如果real-time PCR中有多個(gè)目標基因，閾值必須為每個(gè)目標進(jìn)行設定。

循環(huán)閾值(CT)或交叉點(diǎn)（CP）：擴增曲線(xiàn)穿過(guò)閾值的循環(huán)（即，熒光檢測值顯著(zhù)增加的點(diǎn)）。CT可以是一個(gè)分數，并且可以計算起始模板量。

ΔCT值： ΔCT值描述了靶標基因和相應的內參基因CT值的差值，例如看家基因，并用于標準化模板的使用量：

ΔCT = CT (靶標基因) – CT (內源性參比基因)

ΔΔCT值：ΔΔCT值描述了感興趣樣品（例如，刺激細胞）的平均ΔΔCT值與參考樣本（例如，未刺激細胞）的平均ΔΔCT值之間的差值。參照樣品也被稱(chēng)為校準樣品，并且所有其它樣品進(jìn)行相對定量時(shí)都將被標準化到如此：

ΔΔCT = 平均ΔCT (感興趣樣品) – 平均ΔCT (參比樣本)

內源性參比基因：e這種基因的表達水平在樣品間不存在差異，例如看家基因(3)。對比內參基因與靶標基因的CT值可以將靶標基因的表達水平歸一化到輸入的RNA或cDNA的量（見(jiàn)上面關(guān)于ΔCT值部分）。反應中模板的確切數量不確定。內參基因對以下情況作出校正：可能的RNA降解或RNA樣品中存在酶抑制劑的情況，以及RNA含量、逆轉錄效率、核酸回收和樣品處理的變動(dòng)。為了選出最優(yōu)的參照基因（多個(gè)），我們對算法進(jìn)行了改進(jìn)，允許其選擇依賴(lài)于實(shí)驗設置最優(yōu)參照（4）。

內參：在同一反應中被作為靶序列擴增的，并用不同的探針（即，進(jìn)行雙重PCR）檢測的對照序列。內參經(jīng)常被用來(lái)排除失敗的擴增，例如沒(méi)有檢測到目標序列的情況。

標定樣品：在相對定量中使用的參比樣品（例如，源自細胞株或組織純化的RNA），用以與所有其他樣品進(jìn)行比較，以確定某一基因的相對表達水平。標定樣品可以是任何樣品，但通常是一個(gè)對照品（例如，未處理的樣品或來(lái)自實(shí)驗零時(shí)的樣品）。

陽(yáng)性對照：使用已知量模板的對照反應。陽(yáng)性對照通常用來(lái)檢查引物集或引物–探針集工作是否正常，以及反應是否正確設置。

無(wú)模板對照（NTC）：包含除模板之外的所有擴增反應所必要組分的對照反應。這使得發(fā)現由于污染的試劑或外源DNA造成的污染成為可能，例如從以前的PCR中。

無(wú)RT對照： RNA制備物可能含有殘留的基因組DNA，如果檢測不被設計為僅檢測和擴增RNA序列,其可以在real-time RT-PCR中進(jìn)行檢測。DNA污染可以通過(guò)操作在其中沒(méi)有加入逆轉錄酶的RT對照反應來(lái)進(jìn)行檢測。

標準品：已知濃度或拷貝數，用于構建標準曲線(xiàn)的樣品。

標準曲線(xiàn)：要生成標準曲線(xiàn)，CT值/不同標準稀釋的交叉點(diǎn)對標準物質(zhì)輸入量的對數繪圖。標準曲線(xiàn)通常是使用至少5種不同濃度的標準稀釋倍比生成。每個(gè)標準曲線(xiàn)，應檢查其有效性，斜率值落在–3.3到–3.8之間。標準是各濃度一式三份的理想測定值。標準曲線(xiàn)的斜率如果與這些值差異較大則應該舍棄。

效率和斜率：標準曲線(xiàn)的斜率提供了對real-time PCR的效率指示。斜率–3.322表示該PCR具有數值為1的效率，或100％的效率，并且PCR產(chǎn)物的量在每個(gè)循環(huán)增加到兩倍。效率小于–3.322（例如，–3.8）則表示PCR的效率<1。通常，大多數擴增反應因為實(shí)驗的限制不能達到100％的效率。斜率大于–3.322（例如，–3.0）表明PCR效率似乎是大于100％的。當在反應中的非線(xiàn)性期對值進(jìn)行測量時(shí)可能發(fā)生這種情況，或者它可以指示是否有抑制劑存在。