HPLC使用中的七個(gè)常見(jiàn)錯誤

    由于沒(méi)有考慮到使用一些可以替代的辦法，目前還有七種傳統做法仍然存在于HPLC的技術(shù)應用中，而這些做法其實(shí)非常不利于HPLC技術(shù)的效率提高、運行成本的降低以及運行時(shí)間的縮短。本文中將提出一些可行的傳統做法的替代方法，有些人可能會(huì )對這些替代方法出現爭議，但如果應用得當的話(huà)，這些替代方法勢必會(huì )產(chǎn)生顯著(zhù)的效果。因為相比不停地機械勞作，分析科學(xué)家應該更聰明地工作。

    常見(jiàn)錯誤之一——色譜柱用粒徑5µm的顆粒填充

　　回想一下，多年來(lái)標準HPLC分析柱(250mm×4.6mm)都是采用5µm 粒徑顆粒填裝的，然而，事實(shí)上3µm 粒徑顆粒填裝的色譜柱(150mm×4.6mm)具有更好的分離效果及更短的分析時(shí)間。同時(shí)，現在許多實(shí)驗室標配的色譜儀是超高壓液相色譜(UHPLC)和液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)，所以色譜柱更應該換成3µm 或sub-2µm 填裝的色譜柱。

　　值得注意的是：3µm 粒徑顆粒填裝的色譜柱進(jìn)口孔隙更小，更容易被“臟”的樣品堵塞。

　　常見(jiàn)錯誤之二——使用4.6mm內徑色譜柱(1mL/min)

　　自20世紀70年代初，HPLC分析柱的“標準”內徑就已經(jīng)是4.6mm了，而近年來(lái)，在努力減少溶劑消耗、節約樣品的目標下，許多實(shí)驗室已經(jīng)開(kāi)始將3.0mm內徑的色譜柱作為更好的選擇，來(lái)代替使用4.6mm內徑色譜柱了。如果使用現代的中間分散HPLC儀的話(huà)，柱率和柱外頻帶展寬的效果通常不會(huì )受到任何負面影響�？傊�，使用較小內徑的色譜柱是有利的，在梯度洗脫條件下可以獲得更高的分辨率。

　　常見(jiàn)錯誤之三——對HPLC的流動(dòng)相進(jìn)行過(guò)濾

　　通常經(jīng)凈化系統所得的HPLC級溶劑和水已經(jīng)足夠干凈了，如果我們再給它一次額外的過(guò)濾，那只會(huì )適得其反，引入不必要的化學(xué)污染。事實(shí)上，許多實(shí)驗室都有自己的一套色譜儀器保養維修計劃，每年對HPLC系統中的過(guò)濾器進(jìn)行更換，所以我們沒(méi)有必要再對流動(dòng)相進(jìn)一步過(guò)濾。

　　例外的是：如果你使用的是離子對試劑、低純度緩沖劑或高鹽含量的流動(dòng)相時(shí)，仍然強烈建議你對流動(dòng)相進(jìn)行過(guò)濾。

　　還有一種情況是有必要進(jìn)行額外過(guò)濾的，即如果由于水源的質(zhì)量不好或者其他原因導致從凈化系統流出的水不夠干凈的時(shí)候。

　　常見(jiàn)錯誤之四——使用緩沖劑流動(dòng)相

　　當分析酸性或者堿性分析物的時(shí)候，有必要對流動(dòng)相進(jìn)行酸化或者堿化。簡(jiǎn)單的流動(dòng)相如含0.1%(體積比)甲酸的水溶液，僅需要將1mL甲酸定容到1升水中即可迅速制備。同樣，含0.1%(體積比)氨的水溶液可以用于多種高pH值兼容柱。當使用低硅羥基活性柱時(shí)，無(wú)論用低還是高pH值流動(dòng)相運行，緩沖劑其實(shí)都很少用到，包括以流動(dòng)相A為稀釋劑配制進(jìn)樣樣品溶液時(shí)。

　　例外的是：當分析復雜分子、復雜混合物時(shí)，可能仍然需要用緩沖劑流動(dòng)相，以保持高的選擇性和特別適中的pH值的流動(dòng)相。

　　常見(jiàn)錯誤之五——每次試驗都重新配制新的參考標準溶液

　　在藥品的質(zhì)量控制實(shí)驗室中，往往每個(gè)試驗都會(huì )重新配制新的參考標準溶液，實(shí)際上這是沒(méi)有必要的。許多藥物在低溫和適當的貯存條件下溶液具有足夠的穩定性。所以你可以一次性配制幾百個(gè)合格的參考標準溶液置于HPLC小瓶中，然后冷藏或冷凍貯存供以后分析用。而對于試驗結果的長(cháng)期穩定性研究來(lái)說(shuō)，更應該采用由同一個(gè)原始溶液配制而成的標準溶液。當然，對于通常的試驗，標準溶液的儲存條件下的穩定性(保質(zhì)期)是應該經(jīng)過(guò)驗證的，并記錄首次配制時(shí)間。這里值得我們注意的是：所有的操作都需要做好記錄。

　　常見(jiàn)錯誤之六——對樣品瓶進(jìn)行搖動(dòng)

　　搖動(dòng)(或反轉)樣品瓶會(huì )在樣品瓶蓋下面形成一層液體膜，這會(huì )對HPLC自動(dòng)進(jìn)樣器造成干擾以至于給出一個(gè)混亂的試驗結果。所以即使在排除了故障的情況下，也要始終警惕這一點(diǎn)。

　　例外的是：如果樣品是冷凍過(guò)的，那么解凍后，需要進(jìn)行渦旋或搖動(dòng)以確保樣品均勻。

　　常見(jiàn)錯誤之七——使用不銹鋼卡套作為柱的接頭

　　HPLC系統通常安裝有不銹鋼接頭和套圈，大多數情況下它們工作得都很好，但是它們不適合用于需要頻繁更換色譜柱時(shí)的連接。

　　首先，不銹鋼卡套只能與為其量身定制的端部管接頭相匹配，而對于不同的色譜柱來(lái)說(shuō)這種“量身定制”只會(huì )適得其反。

　　其次，預制的不銹鋼接頭只能夠重復密封5-10次。當某些制造商的不銹鋼接頭用于其他品牌的色譜柱時(shí)，由于不同端部接頭和插入深度的關(guān)系，這個(gè)問(wèn)題會(huì )變得尤其明顯。

　　一個(gè)可能的解決方案是使用可以用手指擰緊的聚醚醚酮(PEEK)管件，它們價(jià)格低廉，并且在5000psi(34.47MPa)壓力下的密封效果也很好。許多較新的UHPLC接頭，其額定壓力為20,000psi(137.9MPa)，只需用手指擰緊，然后用扳手再轉四分之一圈就可以