熒光顯微鏡技術(shù)原理和方法

　　1)訓練目的：學(xué)習熒光顯微鏡的使用；了解熒光顯微鏡技術(shù)原理和方法。

　　2)實(shí)驗材料 リンク： http://web.sgihara.comUGG 通販 モンクレール レディース ニューバランス 激安 ：生物素標記的dUTP(Biotin-dUTP)或地高辛標記的duUTP(Digoxingening-11-dullP)1 nmol／μL,TdT酶(25U／μL)，反應緩沖液，洗滌緩沖液，異硫氰酸熒光素(FITC)標記的親合素或鏈霉親合素(2.5μg/mL)或抗地高辛抗體(1：30)，PI染液(含PI 5μg/mL)，PBS緩沖液，蓋玻片，培養的貼壁細胞，懸浮細胞的甩片或涂片，冰凍切片，常規石蠟切片。

　　3)操作步驟
　　①固定：培養細胞的制片或冰凍切片用4％多聚甲醛固定30min(4℃冰箱)后，用80％酒精再固定2h(20℃冰箱)；常規4％中性福爾馬林固定、石蠟切片進(jìn)行脫蠟、水合。
　　②洗滌：將玻片浸入PBS緩沖液，搖床上洗滌5min，洗3次。
　　③反應：洗滌后的玻片用吸水紙吸干細胞或組織周?chē)�水分，�?FONT face=Calibri>50μL／cm2滴加反應液(每50μL反應液含TdT酶0.5μL，標記的dUTP 1μL)，使反應液均勻地覆蓋于所有細胞或組織切片上，蓋上塑料蓋玻片，置濕盒中，37℃孵育1h。
　　④終止反應：去掉塑料蓋玻片，將玻片置于盛有洗滌緩沖液的染色缸內，洗滌2次，每次5min。
　　⑤FITC標記：洗滌后的玻片用吸水紙吸去細胞或組織周?chē)�水分，�?/FONT>50μL／cm2滴加FITC反應液(含FlTC 2.5μg/mL)，室溫下避光孵育10min。
　　⑥洗滌：將玻片置于洗滌緩沖液內，洗2次，每次5min。
　　⑦PI復染：將玻片置于盛有Pl染液的染色缸內，室溫下避光染色30min。
　　⑧封片：用蓋玻片直接蓋在含PJ染液的玻片上，也可用無(wú)色指甲油涂于蓋玻片四周邊緣，置暗盒中，鏡檢觀(guān)察。