用流式細胞儀檢測細胞凋亡

　　細胞凋亡的檢測方法眾多，流式細胞儀檢測凋亡，是常用的方法。由于流式細胞儀固有的特點(diǎn)---可以準確的進(jìn)行凋亡細胞的計數。因此，具有其它方法無(wú)可比擬的優(yōu)越性。下面我們就簡(jiǎn)單明了地介紹流式在檢測凋亡方面的應用。

　　在凋亡誘導劑的作用下，首先是細胞色素C和apa f-1形成復合體，線(xiàn)粒體的功能發(fā)生衰退;后是caspase家族激活，磷脂酰絲氨酸外翻，這時(shí)細胞的形態(tài)已經(jīng)發(fā)生了改變，可以看到細胞變小，胞核皺縮;最后是細胞內DNA斷裂，形成凋亡小體。

　　在凋亡發(fā)生的各個(gè)過(guò)程當中，都有相應的流式細胞儀的檢測方法，可以采用以下檢測方法：①線(xiàn)粒體功能 ②DNA Cycle ③Caspases ④Annexin V Assay ⑤DNA Fragmentation Assays基本上涵蓋了細胞凋亡的各個(gè)期，對各種檢測方法的原理和特點(diǎn)做一個(gè)簡(jiǎn)單介紹。

　　線(xiàn)粒體功能檢測的試劑盒其檢測主要采用陽(yáng)離子型熒光染料。原理是：正常細胞中，染料可以在線(xiàn)粒體內聚集，發(fā)出明亮的紅色熒光;而細胞凋亡后，其線(xiàn)粒體膜電位發(fā)生改變，染料無(wú)法進(jìn)入線(xiàn)粒體，只能在胞質(zhì)中以單體形式存在，發(fā)出綠色的熒光�？梢栽跓晒怙@微鏡下，或流式檢測。采用488nm激發(fā)，其檢測波長(cháng)分別是527nm和590nm。整個(gè)實(shí)驗過(guò)程操作簡(jiǎn)單，只需要30min就可以見(jiàn)到結果。

　　Caspase家族可以檢測的分子非常多，也有不少商業(yè)的試劑盒可以應用。即使沒(méi)有相應的試劑盒，只要有相應抗體基本上是可以檢測的，具體的方法是參照細胞內蛋白檢測的步驟。

　　在細胞凋亡過(guò)程中伴隨著(zhù)一系列的形態(tài)特征改變，細胞膜的改變是這些特征中較早出現的一種。在凋亡細胞中，細胞膜磷脂酰絲氨酸(PS)從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的外側。Annexin-V是一種35~36KD的鈣粒子依賴(lài)的磷脂結合蛋白，它對PS具有較高的親和力。細胞凋亡時(shí)，可以和外翻的PS結合，從而可以檢測凋亡的細胞。發(fā)生死亡的細胞其細胞膜上的PS也外翻，因而也會(huì )陽(yáng)性。因此，常用的凋亡試劑盒除了采用Annexin-V標記之外，還會(huì )加一種DNA染料，常用的有PI和7-AAD，由于死亡的細胞膜通透性增高，染料可以進(jìn)入細胞內和DNA結合，從而可以發(fā)熒光，區分出死細胞。

　　在采用Annixin V方法檢測凋亡細胞時(shí)，要特別強調一點(diǎn)：該方法適用于懸浮生長(cháng)的細胞，如：淋巴細胞等細胞的檢測。對于貼壁生長(cháng)的細胞，由于在胰酶等消化處理過(guò)程中會(huì )造成細胞膜的損傷，會(huì )造成較高的假陽(yáng)性，從而影響檢測結果。盡管目前，包括國外也有一些單位采用該方法檢測貼壁生長(cháng)的細胞。我不推薦用該方法檢測。因為其重復性較差，且需要操作時(shí)非常小心。

　　DNA周期檢測原本是用來(lái)反應細胞各個(gè)期，即細胞增殖狀況的。利用細胞內DNA能夠和熒光染料，如PI結合的特性。細胞各個(gè)時(shí)期由于其DNA含量不同從而結合的熒光染料不同，流式檢測的熒光輕度也不一樣。G2-M期DNA含量是G0-G1的兩倍，而S期介于兩者之間。

　　但是由于發(fā)現凋亡的細胞DNA含量較少，因而可以在細胞G0-G1期前面有一個(gè)亞二倍體峰，從而認為是凋亡細胞。但是由于死亡的細胞本身其DNA含量也是減少的，因而非常難于區分凋亡和死亡的細胞。在90年代，該方法曾經(jīng)風(fēng)靡一時(shí)，現在看來(lái)，那時(shí)的實(shí)驗結果需要推敲。盡管，經(jīng)典的流式檢測資料給出的圖是認為凋亡的細胞是緊挨著(zhù)G0-G1期峰的一個(gè)峰，死亡的細胞峰離G0-G1期峰較遠，但是這種典型的結果似乎很難獲得。有其它的替代方法，完全可以不用這種方法。

　　晚期凋亡的細胞由于DNA的斷裂，因而可以出現DNA ladder，從而也就有了經(jīng)典的檢測方法TUNEl。流式也能進(jìn)行Tunel檢測，其檢測原理與經(jīng)典Tunel原理基本一致。利用TdT能將熒光素標記的dUTP標記到斷裂的DNA末端，從而使凋亡的細胞具有熒光。但是由于在細胞內標記，細胞需要進(jìn)行固定處理，操作類(lèi)似免疫組織化學(xué)法，容易造成假陽(yáng)性。建議采用原裝大廠(chǎng)的試劑盒，并且嚴格的設立對照。經(jīng)過(guò)預實(shí)驗方法穩定后再進(jìn)行大規模實(shí)驗。標本處理后，均可以用熒光纖維鏡進(jìn)行觀(guān)察，拍照。流式檢測后，可以進(jìn)行精確的計算凋亡百分比。這一點(diǎn)，經(jīng)典TUNEl是做不到的。