牛奶中β-內酰胺酶檢測方法

“無(wú)抗奶”，顧名思義，即不含抗生素的牛奶。早在2002年，這一概念便被提出，“無(wú)抗生素”的字樣也登上了乳品包裝。

為何牛奶含抗生素？
牛奶中的抗生素來(lái)自乳牛，乳牛被注射抗生素，主要是治療乳腺發(fā)炎。乳腺炎是奶牛常見(jiàn)病，抗生素的使用是業(yè)內“公開(kāi)的秘密”。牛奶中的抗生素可能導致飲用者過(guò)敏，或因長(cháng)期接觸抗生素而耐藥。

如何做到“無(wú)抗”？
藥品合理間隔期后才擠奶，可以生產(chǎn)無(wú)抗奶，可以通過(guò)檢驗抗生素的方式驗證。

1、間接法
方法原理：利用β-內酰胺酶能夠酶解青霉素的原理，向牛奶中添加一定量的青霉素，如果牛奶中存在一定濃度的β-內酰胺酶，那么青霉素經(jīng)β-內酰胺酶酶解后濃度會(huì )減少，從而判斷牛奶中是否存在β-內酰胺酶。

實(shí)驗步驟：稱(chēng)取20g試樣，在4℃、16000rpm條件下離心10min。取下層清液10g于50mL塑料離心管，并將塑料離心管置于37℃水浴鍋中振蕩孵育30 min。向孵育后的離心管中加入無(wú)水乙醇15mL。振蕩提取30min后離心，將上層清液過(guò)濾紙后收集于梨形瓶中。減壓濃縮蒸發(fā)掉乙醇。向旋蒸后的梨形瓶中加入10 mL磷酸鹽緩沖液（pH=8.5），渦旋1min后調節pH為8.5。以1mL/min的速度將提取液通過(guò)經(jīng)過(guò)預處理的Oasis HLB固相萃取柱，用2mL磷酸緩沖液（pH=8.5）淋洗萃取柱，再用2mL水淋洗。最后用3mL乙腈洗脫。將洗脫液在40℃下氮氣吹干，用0.025M磷酸鹽緩沖液（pH=7.0）定容殘渣至1mL，待上機測定。

2、直接法
方法原理：牛乳中的青霉素鉀在β-內酰胺酶的作用下，主要生成青霉噻唑酸鉀，并伴隨生成少量的青霉胺、青霉醛等物質(zhì)。經(jīng)去脂肪、蛋白等前處理后，可以將青霉噻唑酸鉀提取出來(lái)，經(jīng)高效液相色譜儀檢測確認其是否存在，從而判定該牛乳是否為人造“無(wú)抗奶”。

實(shí)驗步驟：稱(chēng)取20g試樣，在4℃、16000rpm條件下離心10min。取下層清液10g于50mL塑料離心管，加入無(wú)水乙醇15 mL，振蕩提取30min后離心，取清液經(jīng)0.45μm的濾膜過(guò)濾，用高效液相色譜儀檢測。

標準溶液配制：稱(chēng)取0.01g（精確至0.001g）青霉素鉀于100ml容量瓶中，加入1ml市售抗生素分解劑，室溫放置2h使青霉素鉀酶解完全后用去離子水定容，得到青霉噻唑酸鉀標準溶液，濃度100μg/mL。根據實(shí)際情況稀釋后使用。