融合蛋白的免疫篩選實(shí)驗

實(shí)驗材料    大腸桿菌 
試劑、試劑盒    LB頂層瓊脂糖疊氮鈉第一抗體 
儀器、耗材    硝酸纖維素濾膜 
抗體    CD2抗體 
山羊Lambda Light Chain多克隆抗體 
山羊Complement C4多克隆抗體 

實(shí)驗步驟：     
1. 在150 ml LB平板上滴定λgt11 cDNA文庫的滴度，宿主菌為大腸桿菌LE392菌株，每個(gè)平板使用7 ml 1%LB頂層瓊脂。 
2. 選擇適當的滴度鋪平板，于37℃溫育8h。 
3. 將直徑132 mm硝酸纖維素濾膜分別編號，放入上述已培養8 h的平板中，于37℃溫育。 
4. 用針頭刺孔并用印度墨汁在每張濾膜上作一標記，然后取出濾膜。 
5. 在室溫用免疫篩選緩沖液洗膜30 min，以封閉濾膜并洗去膜上的殘留細菌，重復洗滌2~4次。 
6. 將第一抗體（稀釋于免疫篩選緩沖液中，終濃度為0.5~10 μg/ml）加到裝有濾膜的塑料袋中，熱封口后置40℃水平搖床上反應2~24h。 
7.  于4℃用免疫篩選緩沖液洗膜4~5次，毎次5~10min。 
8.  接著(zhù)將125I 標記的第二抗體（0.5×106cpm/ml）加入裝有濾膜的熱封塑料袋中，4℃反應2~6 h。 
9.  在4℃用免疫篩選緩沖液洗膜4~5次，然后用濾紙將濾膜上的液體吸干。 
10.  用塑料保鮮膜包裹好濾膜，使用增感屏在-70℃對X光片曝光。 
11.  通過(guò)反復稀釋?zhuān)�純化λ噬菌體cDNA融合蛋白克隆，最終獲得單一的陽(yáng)性克隆。 
12.  培養陽(yáng)性克隆，制備重組λ噬菌體DNA。 

IPTG法 
實(shí)驗方法原理：用抗體篩選λgt11 cDNA文庫時(shí)，可待噬斑長(cháng)到一定裎度方可誘導表達融合蛋白，篩選到陽(yáng)性克隆的成功概率就可能大大增加。噬菌體生長(cháng)3~4 h后，將含誘導劑IPTG的濾膜放入噬斑平板，即可誘導β-半乳糖苷酶-cDNA融合蛋白的表達，繼續在37℃培養，然后按基本方案用抗體對影印濾膜進(jìn)行篩選。 

實(shí)驗材料    大腸桿菌 
試劑、試劑盒    IPTG 
儀器、耗材    培養箱牙簽硝酸纖維素膜 
抗體    CD2抗體 
山羊Lambda Light Chain多克隆抗體 
山羊Complement C4多克隆抗體 

實(shí)驗步驟     
1.  用1×104~5×104融合有cDNA的λ噬菌體感染0.5~1.0 ml 培養的Y1090新鮮菌懸液。 
2.  加入預熱到47℃的7 ml 頂層瓊脂中，鋪150 mm LB平板，42℃培養3.5 h。 
3.  將132 mm 直徑的硝酸纖維素濾膜故入10 mmol/l IPTG溶液中浸泡后，取出干燥。 
4.  再將含IPTG的濾膜放入噬菌體文庫平板中，37℃培養3.5 h。 
5.  每張濾膜作好標記后取出，封閉濾膜上的剩余的蛋白結合位點(diǎn)并進(jìn)行雜交檢測。