PCR技術(shù)的應用與微生物系統進(jìn)化研究的發(fā)展

　　分類(lèi)和進(jìn)化研究是生物學(xué)中最古老的領(lǐng)域之一。過(guò)去的研究主要依靠生物體的形態(tài)，并輔以生理特征，來(lái)探討生物間親緣關(guān)系的遠近，有人稱(chēng)之為經(jīng)典的方法，它是一百多年來(lái)完成微生物分類(lèi)的主要方法。經(jīng)典的方法是隨機的和不系統的，只適用于一些形態(tài)復雜的真核生物和較大的原核生物�，F在，由于生物技術(shù)的不斷完善，人類(lèi)對自然界的認識水平不斷地提高，就對以前的一些研究方法以及研究結果提出了質(zhì)疑。如長(cháng)久以來(lái)，生物界被劃分為原核、真核兩大界，認為真核生物由原始的原核生物進(jìn)化而來(lái)。但隨著(zhù)對原核生物各類(lèi)群的研究的深入，卻發(fā)現許多生活在極端環(huán)境(高鹽、高溫、極端pH值)的古細菌(Archaebacteria)在生理生化諸多方面與一般的真細菌存在巨大差異，其分子機制亦相當獨特。那么，這類(lèi)古細菌是否應當從原核生物中獨立出來(lái)而自成一個(gè)體系呢？近年來(lái)，由于分子生物學(xué)的迅速發(fā)展和廣泛應用，特別是蛋白質(zhì)和核酸序列研究的突破性進(jìn)展，使微生物系統分類(lèi)的基礎發(fā)生了重大的變化，分類(lèi)系統已經(jīng)或正在隨著(zhù)分子標準的不斷滲入而完善。所謂分子標準主要是指建立在DNA分析技術(shù)基礎上的分類(lèi)方法。與表型特征相比較，核酸序列在生物體的進(jìn)化過(guò)程中較少受到環(huán)境的影響，因而更能反映出生物體在演變進(jìn)化過(guò)程中的本質(zhì)，其研究結論也更可靠。這樣，人們就將系統進(jìn)化研究從宏觀(guān)逐漸轉向微觀(guān)，并把宏觀(guān)和微觀(guān)的特征結合起來(lái)，以便更準確地反映生物體間真正的進(jìn)化關(guān)系。

　　早期的分子標準主要建立在諸如DNA堿基比例測定或核酸分子雜交等基礎上。我們知道，每一種生物體均有其特有的、穩定的核酸成分和結構；不同生物間核酸成分和結構的差異程度代表著(zhù)它們之間親緣關(guān)系的遠近。由此，從核酸分子水平來(lái)研究生物的進(jìn)化關(guān)系就成為分類(lèi)學(xué)的一個(gè)新途徑，微生物分類(lèi)學(xué)也不例外。最早在1956年由Lee等提出了DNA堿基比例的測定方法。DNA堿基比例主要是指“G+Cmol％"比例，即鳥(niǎo)嘌呤(G)和胞嘧啶(C)在整個(gè)DNA中的摩爾百分比。不同種的微生物，其4種堿基的含量及排列順序不同，因此G+Cmol％比例一般會(huì )隨種的不同而有變化。一般來(lái)說(shuō)，G+Cmol％差異愈大，分類(lèi)地位愈疏遠。而G+Cmol％比例相似，可能屬于同種，也可能不是同種，因為堿基成分相似的DNA可能有很多種堿基順序。例如，螺菌屬(Spirillum)的G+Cmol％比例是38％～65％，輻度過(guò)寬。后來(lái)根據其堿基成分和其他特征的不同已被劃分成3屬：螺菌屬(Spirillum，38％)、海洋螺菌屬(Oceanspirillum，42％～48％)和水生螺菌屬(Aquaspirillum，50％～56％)。

　　如前所述，測定DNA的G+Cmol％比例只能確定含量不同的細菌為不同的種，而不能確定含量相近的細菌必然屬于同一個(gè)種。若要進(jìn)一步確定，還必須借助其他方法，例如核酸分子雜交方法。研究DNA-DNA或DNA-RNA雜交最方便的方法，就是采用來(lái)自一個(gè)菌株的放射性核酸與來(lái)自另一個(gè)菌珠的非放射性核酸，經(jīng)熱變性之后，把兩種核酸樣品混合，使其復性，測定放射性結合鍵的百分率。百分率越高，說(shuō)明兩者堿基順序的同源性越高，亦即親緣關(guān)系越近。核酸分子雜交技術(shù)對解決種水平上的分類(lèi)學(xué)問(wèn)題和確定新種是十分有效的。

　　從20世紀70年代初起，16S rRNA序列分析成為細菌分類(lèi)的一個(gè)重要指標。16SrRNA分子具高度的保守性，在30多億年的進(jìn)化中仍保持著(zhù)原初的狀態(tài)，因此可用作探索自古至今生物的主要進(jìn)化歷程，是一種理想的研究材料。1977年，Woese等人測定了200多種原核生物的16SrRNA和真核生物的18SrRNA的寡核苷酸順序譜，經(jīng)比較研究，不但搞清了原核生物和真核生物的許多系統進(jìn)化問(wèn)題，而且還以此為根據提出了生命體系的三界學(xué)說(shuō)，引起了生物學(xué)家的普遍關(guān)注，并由此而引發(fā)了研究古細菌的熱潮。16SrRNA寡核苷酸順序分析所依據的基本原理是這樣的，用可專(zhuān)一性地水解G(鳥(niǎo)嘌呤)上3′端磷酸酯鍵的核糖核酸酶水解提純的rRNA，產(chǎn)生一系列以G為結尾的長(cháng)度不一的寡核苷酸片段，一一測定其核苷酸序列，最后把它們編成一部“詞典"。兩個(gè)菌株rRNA的相似性就可通過(guò)查閱“詞典"來(lái)作比較。但這種方法在當時(shí)是一項工作量大，實(shí)驗條件復雜和操作要求十分嚴格的分析技術(shù)，因此其應用仍然受一定的限制。

　　80年代中期，聚合酶鏈反應(PCR)的出現和完善，以及利用PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行堿基序列分析方法的出現，使迅速得到特定DNA片段的遺傳信息成為現實(shí)，這樣就使得人們可以用完整而不是部分的DNA序列來(lái)判斷生物之間的系統發(fā)育關(guān)系。1996年8月，《SCIENCE》發(fā)表了美國TICR(The Institute for Genomic Research)研究所的最新學(xué)術(shù)成果---產(chǎn)甲烷球菌的全基因組序列。這是自Woese提出三界學(xué)說(shuō)以來(lái)測定的第一個(gè)古核生物(Archaea)的全基因組序列，從而為古核生物的研究提供了充分的序列材料。TIGR給出了產(chǎn)甲烷球菌的1738個(gè)基因的定位，經(jīng)同源性搜索和GENEMARK的基因定位方法研究，結果表明，約有58％的基因在現有生物的基因數據庫中找不到同源序列。這足以說(shuō)明產(chǎn)甲烷球菌上有著(zhù)大量的新基因序列，從而為三界學(xué)說(shuō)的建立和發(fā)展找到了堅實(shí)的證據。

　　在國內，利用PCR技術(shù)研究系統進(jìn)化問(wèn)題尚處起步階段。周培瑾、徐毅等人自1994年起首先開(kāi)展了這方面的工作。他們用PCR技術(shù)擴增了嗜鹽菌的16SrRNA；并在此基礎上將一株從新疆鹽湖分離到的嗜鹽菌B2菌株進(jìn)行了16SrRNA核苷酸序列分析；最后通過(guò)比較它與嗜鹽菌各屬中其他種的16SrRNA序列的相互關(guān)系，鑒定B2菌株為嗜鹽小盒菌屬的一個(gè)新種。他們的工作在國內，特別是嗜鹽菌的系統發(fā)育研究方面尚屬首次。

　　利用PCR方法研究系統進(jìn)化一般要進(jìn)行以下程序：
　　(1)樣品來(lái)源及模板制備 用以抽提模板DNA的樣品只需極少量，且模板用量也極低，只需幾個(gè)納克(新鮮樣品)，抽提過(guò)程較為簡(jiǎn)單，可用經(jīng)典的DNA或RNA提取法。
　　(2)對稱(chēng)PCR 根據選用的引物來(lái)擴增模板DNA的特異性雙鏈片段。這個(gè)過(guò)程引物的設計至關(guān)重要。若設計不合理，擴增出非特異性片段，則會(huì )導致錯誤的推斷。一般來(lái)說(shuō)，引物應位于待分析基因組中的高度保守區域，長(cháng)度以15～30hp為宜。
　　(3)不對稱(chēng)PCR 利用對稱(chēng)PCR的雙鏈產(chǎn)物作為其擴增的模板DNA，控制兩種引物的用量之比為1∶50或1∶100，就可根據單引物來(lái)擴增出特異性的單鏈DNA。
　　(4)堿基序列測定 利用單鏈DNA產(chǎn)物進(jìn)行堿基序列分析。這項工作因自動(dòng)測序儀的出現而變得簡(jiǎn)單易行。
　　(5)DNA序列數據分析 通過(guò)PCR得到特異性DNA片段的堿基序列只是進(jìn)化研究工作中的一個(gè)中間環(huán)節，最終還必須對這些數據進(jìn)行分析推斷，對序列數據分析的方法很多。

　　目前，PCR技術(shù)在系統進(jìn)化研究中得到廣泛應用，PCR途徑對模板DNA的純度要求不高，所需樣品量也極低，這就為抽提過(guò)程簡(jiǎn)單化創(chuàng )造了條件�？芍苯拥玫胶塑账岬恼鎸�(shí)序列。這樣，通過(guò)序列之間的直接比較，就更能說(shuō)明問(wèn)題，所得結果也更可靠。另外，在原有PCR技術(shù)基礎上結合各種生化分子生物學(xué)技術(shù)，還衍生了許多改良技術(shù)，大大方便了這方面的研究工作。如PCR-SSCP是最近發(fā)展起來(lái)的一種非同位素、快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高的檢測基因突變的新技術(shù)，目前被廣泛應用于篩選DNA點(diǎn)突變。再如PCR-RAPD可通過(guò)任意選擇一個(gè)或二個(gè)引物，對基因組DNA進(jìn)行擴增。擴增產(chǎn)物可經(jīng)1.5％～2％瓊脂糖電泳或在擴增的同時(shí)摻入32P，然后經(jīng)6％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，放射自顯影得到DNA指紋圖譜。其他還有諸如PCR定量檢測技術(shù)、PCR-RELP等等。另外，繼PCR擴增技術(shù)之后，又有一種新的核酸擴增技術(shù)---NASBA技術(shù)問(wèn)世了。它與PCR不同的是：PCR技術(shù)要求有3個(gè)不同的溫度，而NASBA只需在一種溫度下就可以完成反應；NASBA的核酸擴增效率甚至比PCR的擴增效率還要高，2小時(shí)內目的基因可以擴增109倍；更主要的是NASBA能直接擴增單鏈RNA上的特異序列，這對RNA的研究意義非常重大。相信這項新技術(shù)的出現和廣泛應用將大大加快各領(lǐng)域中的各項研究。

　　總之，現代分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，給系統進(jìn)化研究帶來(lái)了越來(lái)越多的便利和可靠性，隨之也推動(dòng)了微生物系統發(fā)育學(xué)的建立和發(fā)展。據報道，在不遠的將來(lái)，以表型為主的分類(lèi)體系將發(fā)生大的變化，從而能更精確地反映微生物間的系統發(fā)育關(guān)系。